一种牛膝多糖、其制备工艺和用途制造技术

本发明专利技术涉及一种牛膝多糖、其制备工艺和用途。所述牛膝多糖的平均分子量为1000

【技术实现步骤摘要】
一种牛膝多糖、其制备工艺和用途


[0001]本专利技术属于多糖
，具体涉及一种牛膝多糖、其制备工艺及在制备抗肝纤维化药物中的用途。

技术介绍

[0002]肝纤维化是指由各种致病因子诱发肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程。其发病机制为当肝脏遭到各种致病因子侵袭后，诱发肝脏损伤与炎症反应，肝组织免疫系统被激活，进行组织修复，当这种组织修复过程过度及失控时，肝组织内细胞外基质过度增生与异常沉淀就会导致肝脏结构和肝功能异常改变。它不是一种独立的疾病，是大多数慢性肝病的共同过程及主要病因之一，也是进一步向肝硬化、肝癌等疾病发展所经历的病理阶段。因此，找到一种可有效治疗肝纤维化的药物具有重要的临床意义。
[0003]肝纤维化是由多种细胞因子和分子途径参与的复杂病理过程。所以，多糖因其具有多环节、多途径、多层次、多靶点的作用特点以及能够整体调节器官组织病理过程的优点，在临床抗肝纤维化的治疗方面具有非常突出的优势，应用前景广阔。
[0004]牛膝，中药名。又名百倍、鸡胶骨，为苋科牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根，是我国传统中药，归肝、肾经，具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨、利尿通淋等功效。目前对于牛膝的化学成分研究，主要集中在牛膝苷等小分子化合物。牛膝多糖的药理活性集中在免疫及骨形成方向，而鲜有对于牛膝多糖用于肝纤维化治疗药物方面的研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个方面提供一种牛膝多糖，所述牛膝多糖的平均分子量为1000r/>‑
20000Da。
[0006]在所述牛膝多糖中，含有果糖与葡萄糖的摩尔比为5～10:1。
[0007]在所述牛膝多糖中，连接方式包括α
‑
D
‑
Glcp
‑
(1
→
、β
‑
D
‑
Fruf
‑
(2
→
、
→
1,6)
‑
β
‑
D
‑
Fruf
‑
(2
→
、
→
1)
‑
β
‑
D
‑
Fruf
‑
(2
→
和
→
2)
‑
β
‑
D
‑
Fruf
‑
(6
→
。
[0008]本专利技术的另一个方面提供所述牛膝多糖的制备方法，所述方法包括：以干燥的牛膝根为原料，经沸水提取、浓缩、透析、醇沉得粗多糖后，进一步过离子交换柱层析得到牛膝多糖。
[0009]特别地，所述牛膝多糖的制备方法包括：
[0010](1)干燥的牛膝根茎粉碎成粉末，经沸水提取、浓缩提取液并透析、乙醇沉淀多糖、收集沉淀物、冷冻干燥得到粗多糖；
[0011](2)粗多糖在DEAE
‑
Sepharose快流柱上进一步分离纯化，依次用蒸馏水、0.05、0.1、0.2、0.4M NaCl溶液逐步洗脱，收集0.2M NaCl洗脱组分得纯化得到牛膝多糖。
[0012]特别地，上述步骤(1)如下进行：干燥的牛膝根茎粉碎成粉末，经沸水提取2h、浓缩提取液并透析3天、乙醇沉淀多糖、离心收集沉淀物、冷冻干燥得到粗多糖。
[0013]特别地，上述步骤(2)如下进行：取粗多糖，水溶解，离心，上清液通过DEAE
‑
Sepharose快流柱上进一步分离纯化，依次用蒸馏水、0.05、0.1、0.2、0.4M NaCl溶液逐步洗脱，硫酸
‑
苯酚检测，收取合并0.2M NaCl洗脱液，浓缩，透析，冷冻干燥得牛膝多糖。
[0014]特别地，透析时透析袋的截留分子量为3500Da。
[0015]本专利技术的又一方面提供所述牛膝多糖在制备用于治疗肝纤维化的药物中的用途。
[0016]其中所述多糖是通过抑制肝星状细胞激活、抑制细胞外基质的生成，从而起到抑制肝纤维化的功效。
[0017]因此，本专利技术的又一方面提供所述牛膝多糖在制备用于抑制肝星状细胞激活和/或抑制细胞外基质的生成的药物中的用途。
[0018]本专利技术通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本专利技术的内容。
附图说明
[0019]图1为实施例1制备的牛膝多糖ABWW的1H NMR谱图(A)和
13
C NMR谱图(B)。
[0020]图2显示实施例1制备的牛膝多糖ABWW在细胞水平上抑制肝星状细胞激活的作用；其中，A.ABWW浓度依赖的抑制肝星状细胞Fibronectin、α
‑
SMA、COL1A1的蛋白表达量。B
‑
D.ABWW浓度依赖的抑制肝星状细胞Fibronectin、α
‑
SMA、COL1A1的mRNA表达量。
[0021]图3显示实施例1制备的牛膝多糖ABWW在动物水平上改善四氯化碳诱导的肝纤维化作用；其中A.天狼星红染色结果提示ABWW抑制肝组织中胶原沉积；B.马松三色染色结果提示ABWW抑制肝组织中胶原沉积；C.Western Blot结果提示ABWW抑制肝脏中TGF
‑
β1、α
‑
SMA蛋白表达量。
具体实施方式
[0022]实施例1：牛膝多糖ABWW的制备
[0023]a.牛膝粗多糖提取：
[0024]干燥的牛膝根茎粉碎成粉末。然后将粉末(5.0kg)浸入100L水中并用沸水提取2h。浓缩提取液并使用透析膜(MWCO 3500Da)在自来水中透析3天。加入乙醇(95％)沉淀多糖(乙醇：浓溶液＝3:1)。通过离心收集沉淀物(RCF＝14430g，10min)。沉淀经冷冻干燥得到粗多糖(264.2g，收率5.3％)。
[0025]b.多糖纯化：
[0026]上述粗多糖在DEAE
‑
Sepharose快流柱(5cm
×
50cm)上进一步分离。具体而言，将牛膝粗多糖(7.7g)溶解于100mL蒸馏水中，搅拌并离心。将上清液应用于DEAE
‑
Sepharose快速流动柱，并用蒸馏水、0.05、0.1、0.2、0.4M NaCl溶液逐步洗脱。根据苯酚
‑
硫酸法的洗脱曲线汇集洗脱液。收取合并0.2M NaCl洗脱液，浓缩，透析，冷冻干燥得ABWW多糖866mg。
[0027]c.多糖结构鉴定：
[0028]1.采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定分子质量
[0029]ABWW多糖的分子量和纯度采用HPGPC方法测定。具体而言，样品以流动相配制成1～2mg/mL的多糖溶液。采用两根多糖凝胶色谱柱串联，Waters Ultra hydrogel TM 500(排阻极限1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛膝多糖，所述牛膝多糖的平均分子量为1000
‑
20000Da。2.权利要求1所述的牛膝多糖，其中，含有果糖与葡萄糖的摩尔比为5～10:1。3.权利要求1所述的牛膝多糖，其中，连接方式包括α
‑
D
‑
Glcp
‑
(1
→
、β
‑
D
‑
Fruf
‑
(2
→
、
→
1,6)
‑
β
‑
D
‑
Fruf
‑
(2
→
、
→
1)
‑
β
‑
D
‑
Fruf
‑
(2
→
和
→
2)
‑
β
‑
D
‑
Fruf
‑
(6
→
。4.一种牛膝多糖的制备方法，包括：以干燥的牛膝根为原料，经沸水提取、浓缩、透析、醇沉得粗多糖后，进一步过离子交换柱层析得到牛膝多糖。5.权利要求4所述的牛膝多糖的制备方法，包括：(...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁侃，杜振云，靳灿，陈霞，
申请(专利权)人：中国科学院上海药物研究所，
类型：发明
国别省市：