一种幼雏鸽性别鉴定方法及鉴定用PCR引物技术

本发明专利技术提供一种用于快速鉴定幼雏鸽性别的引物、试剂及方法，引物针对雌性鸽W染色体上特有的EE0.6序列片段设计，并利用Biotin和FAM修饰。检测时，首先使用高效核酸裂解液快速提取羽髓中的DNA，简化了DNA的获得过程；然后经过上述引物特异性PCR扩增，将扩增的PCR产物通过胶体金试纸条有无条带来实现雌性个体鉴定的快速检测，结果直观清晰，辨识度高，极易分辨出鸽性别，验证结果与胶体金试纸结果一致，准确率为100％。利用所述PCR

【技术实现步骤摘要】
一种幼雏鸽性别鉴定方法及鉴定用PCR引物


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种幼雏鸽性别鉴定方法及鉴定用PCR引物。

技术介绍

[0002]中国养鸽业发展迅猛，但由于科研力量投入不足以及鸽子特有的生物学特性，肉鸽养殖技术落后于其他家禽，其中种鸽生产上的性别鉴定难题仍待解决。性别鉴定在鸽子育种和控制养殖成本中尤为重要。不同性别的个体其营养需求不同，性别的早期鉴定将有助于节约饲养成本，提高养殖效率。对于种鸽来说，需要合理的性别比例，如果性别比例不当，不利于繁殖育种。如果在早期就能够对鸽子准确地分离出性别并进行及时地配对，不仅能提高鸽场的生产效率，增加生产效益，还能及早淘汰不必要的雄鸽减少生产成本，尤其在幼鸽期去公留母，在蛋鸽产业中更为突出，因此，早期的性别鉴定有重要实践意义和经济价值。
[0003]但是鸽子属于性别单态鸟，无论是雏鸽还是成年鸽都很难从外观形态或其他行为上加以区分，此外，鸽子是晚成鸟，出生雏不能像一般家禽通过翻肛方式进行性别鉴定。目前，在幼雏鸽性别鉴定方面，主要是通过外貌行为特征、腹腔镜检、粪便类固醇检测及核型等方法进行鸽性别鉴定，但这些方法准确率不高，鉴定过程繁琐，难以在生产上大规模推广。在鸽上应用翻肛法时其正确率只有70％左右。随着分子生物学的发展，针对鸽性别鉴定可以选择一些分子生物学方法，具有准确性高、对动物伤害较小等优点。但已报道的鉴定方法大多需繁琐的基因组抽提步骤，还需琼脂糖凝胶电泳胶分析结果，很难在生产上推广应用。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是提供一种幼雏鸽性别鉴定方法及鉴定用PCR引物，能简单、快速、准确地鉴别幼雏鸽的性别。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术的实施例提供一种幼雏鸽性别鉴定方法，包括如下步骤：
[0006]S1、拔取乳鸽身上带有毛囊的新生羽毛1
‑
2根；
[0007]S2、利用基因组DNA提取试剂提取待测乳鸽的基因组DNA，操作步骤如下：将裂解液A与裂解液B按照24：1混合，然后将带有羽髓的羽毛样品加入混合好的裂解液中，55℃加热15分钟，95℃加热5分钟，再加入终止液，取上清液即获得鸽羽髓的基因组DNA；
[0008]S3、以提取的DNA为模板，利用Biotin和FAM修饰的特异性上下游引物进行PCR扩增；其中，PCR反应体系为：2
×
Taq Master Mix 10μL，浓度为10μmol/L的正向和反向引物各0.8μL，模板DNA 1μL，超纯水7.4μL；PCR反应程序为：95℃预变性3min；延伸按95℃15s，60℃15s，72℃60s进行30个循环；72℃保温5min；4℃结束。
[0009]S4、取1
‑
2μL扩增的PCR引物用胶体金试纸条专用样品稀释液稀释50
‑
100倍后，取50μL加入胶体金试纸条的加样孔，反应2
‑
5min，雄性乳鸽对应的试剂反应后只在胶体金试
纸条的质控线上出现一条条带，检测线处无条带；雌性乳鸽对应的试剂反应后在胶体金试纸条的质控线和检测线上各出现一条条带，以此鉴定乳鸽的性别。
[0010]本专利技术还提供一种幼雏鸽性别鉴定用PCR引物，包括：
[0011]上游引物序列：TCCTATGCCTACCACCTTCCT；
[0012]下游引物序列：TTGAGAAAGAATCTGACCTGAACC。
[0013]本专利技术还提供一种所述的幼雏鸽性别鉴定用PCR引物在幼雏鸽性别鉴定中的应用。
[0014]本专利技术还提供一种幼雏鸽性别鉴定用PCR引物在制备幼雏鸽性别鉴定用试剂盒中的应用。
[0015]本专利技术还提供一种幼雏鸽性别鉴定用试剂盒，包括如权利要求2所述的幼雏鸽性别鉴定用PCR引物，还包括：基因组DNA提取试剂、2
×
Taq Master Mix、超纯水、胶体金试纸条专用样品稀释液。
[0016]本专利技术的上述技术方案的有益效果如下：
[0017]本专利技术提供一种幼雏鸽性别鉴定方法及鉴定用PCR引物对，利用雌雄鸽子性染色体ZW(雌性)和ZZ(雄性)的差异，针对雌性鸽子W染色体上特有的EE0.6序列片段设计引物，并利用Biotin和FAM修饰上下游引物，该引物具有特异性好，分辨率高，扩增结果直观可辨等优点。
[0018]本专利技术采用探索的裂解液简便、快速获取雏鸽羽髓基因组DNA，省掉了商品化DNA提取试剂盒的提取步骤，节约了时间和经济成本。
[0019]本专利技术中PCR产物直接通过胶体金快速检测试纸条的条带数量判断公母，结果直观清晰可辨。且不需要耗时较长(20
‑
30min)的琼脂糖凝胶电泳法来判定结果，符合快速、准确及经济的检测要求，适合在规模化鸽生产及繁育上推广应用。
[0020]本专利技术使用羽毛提取DNA，对鸽子伤害小，运用PCR扩增技术和胶体金快速检测试纸条对鸽子进行性别鉴定，从而缩短了检测时间、提高检测率，降低技术门槛，在鸽子的育种和繁殖中具有极强的创新性。
附图说明
[0021]图1为本专利技术实施例1中21日龄乳鸽的示意图；
[0022]图2为实施例1中利用胶体金试纸对21日龄乳鸽PCR产物快速检测结果；
[0023]图3为实施例1中21日龄乳鸽饲养至28日龄时解剖验证图；
[0024]图4为实施例1中未知公母的21日龄乳鸽性别鉴定核酸电泳胶结果图；
[0025]图5为本专利技术实施例2中6日龄乳鸽的示意图；
[0026]图6为实施例2中利用胶体金试纸对6日龄乳鸽PCR产物快速检测结果图；
[0027]图7为实施例2中未知公母的6日龄乳鸽性别鉴定核酸电泳胶结果图；
[0028]图8为本专利技术实施例3中利用胶体金试纸对已知公母的种鸽快速检测结果图。
具体实施方式
[0029]为使本专利技术要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
[0030]本专利技术提供一种幼雏鸽性别鉴定方法，包括如下步骤：
[0031]S1、拔取乳鸽身上带有毛囊的新生羽毛1
‑
2根；
[0032]S2、利用基因组DNA提取试剂提取待测乳鸽的基因组DNA；操作步骤如下：将裂解液A与裂解液B按照24：1混合，然后将带有羽髓的羽毛样品加入混合好的裂解液中，55℃加热15分钟，95℃加热5分钟，再加入终止液，取上清液即获得鸽的羽髓的基因组DNA。取上清1μL用于PCR扩增，其余贮存在
‑
20℃备用。
[0033]S3、以提取的DNA为模板，利用Biotin和FAM修饰的特异性上下游引物进行PCR扩增；其中，PCR反应体系为：2
×
Taq Master Mix 10μL，浓度为10μmol/L的正向和反向引物各0.8μL，上一步中提取的浓度为40
‑
400μg/mL的模板DNA 1μL，超纯本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种幼雏鸽性别鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、拔取乳鸽身上带有毛囊的新生羽毛1
‑
2根；S2、利用基因组DNA提取试剂提取待测乳鸽的基因组DNA，操作步骤如下：将裂解液A与裂解液B按照24：1混合，然后将带有羽髓的羽毛样品加入混合好的裂解液中，55℃加热15分钟，95℃加热5分钟，再加入终止液，取上清液即获得鸽羽髓的基因组DNA；S3、以提取的DNA为模板，利用Biotin和FAM修饰的特异性上下游引物进行PCR扩增；其中，PCR反应体系为：2
×
Taq Master Mix 10μL，浓度为10μmol/L的正向和反向引物各0.8μL，模板DNA 1μL，超纯水7.4μL；PCR反应程序为：95℃预变性3min；延伸按95℃15s，60℃15s，72℃60s进行30个循环；72℃保温5min；4℃结束。S4、取1
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2μL扩增的PCR引物用胶体金试纸条专用样品稀释液稀释...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫乐艳，陈哲，孙雪峰，周慧，郭彬彬，戴子淳，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：