美洲鲥鱼肌肉组织中提取DNA的方法、五种性别相关的分子标记和应用技术

本发明专利技术公开了美洲鲥鱼肌肉组织中提取DNA的方法、五种性别相关的分子标记和应用，本发明专利技术通过采用了特定的预处理方法对美洲鲥鱼的肌肉组织进行了固定和冷冻，然后再进行肌肉组织的DNA提取，获得了高质量的DNA模板，然后进一步以该方法提取的DNA模板筛选获得了能够区分美洲鲥鱼性别的五种分子标记分子，而且基于以上的五种分子标记进一步获得了能够扩增五对分子标记的特异性引物，本发明专利技术获得的五对特异性引物能够准确区分遗传性性别，本发明专利技术还提供了鉴别美洲鲥鱼性别的分子标记方法，本发明专利技术通过采用从肌肉组织提取DNA的方法，可以更准确的筛选出性别特异性分子标记，保证本发明专利技术中引物对性别鉴定的准确度为100%。引物对性别鉴定的准确度为100%。引物对性别鉴定的准确度为100%。

【技术实现步骤摘要】
美洲鲥鱼肌肉组织中提取DNA的方法、五种性别相关的分子标记和应用


[0001]本专利技术属于鱼类遗传学领域，具体涉及美洲鲥鱼肌肉组织中提取DNA的方法、五种性别相关的分子标记和应用。

技术介绍

[0002]世界上最名贵的鲥鱼品种包括美洲鲥鱼、中华鲥鱼和印度鲥鱼，鲥鱼养殖和繁殖一直是困扰国内外鱼类生物学家和养殖技术人员的难题，其养殖和繁殖的成功案例在国内外鲜有报道。因为鲥鱼具有与普通养殖鱼类完全不同的生理特性，它对外界环境变化极为敏感，身体娇嫩、娇气急躁、应激反应强，极易受伤致死。上个世纪末，我国学者对中华鲥鱼养殖和人工繁殖进行了初步研究，但结果不尽人意。中华鲥的资源日益衰竭，已难见踪迹。在中华鲥濒临灭绝情况下，本团队自2003年，在鲥鱼生物学、行为特性和养殖技术等方面空白的情况下，进行美洲鲥鱼的引进、驯养、人工繁殖和育苗以及种质改良等方面的研发。近20年来，本团队以“十年磨一剑”、“摸着石头过河”的精神，在美洲鲥鱼养殖生物学、繁殖和育苗、和种质改良等方面取得了多项成果，引领鲥鱼养殖产业发展。在养殖成功的基础上，开展鲥鱼繁殖方面的尝试并产业化，彻底摆脱了鲥鱼养殖产业长期依赖进口受精卵的局面。
[0003]在美洲鲥鱼品系选育、全基因组学测序和简化基因组测序技术的基础上，本团队分离出5个美洲鲥鱼的雄性分子标记，鉴别xx假雄鱼(neomales)，成功应用于全雌鲥鱼的生产。全雌养殖发挥了雌鱼生长快的优势，生产价格昂贵的大规格鲥鱼，更重要的是，可有效避免雄鱼在春季追尾造成的大量死亡和体重降低的损失，从而提高养殖效率28％以上，成为促进鲥鱼养殖业发展的重要措施。本技术从鲥鱼养殖产业链的源头和养殖模式的更新提供关键技术的支撑，可持续地提高鲥鱼养殖产业的效率，对世界其他鲥鱼品种的养殖产业开发有着重要的意义。
[0004]而其他鱼体的的特异性分子标记技术多采用鱼尾鳍和鳞片进行DNA提取，但是实际上鱼尾鳍和鳞片坚硬，研磨不彻底容易造成DNA提取浓度偏低，引起引物扩展序列不准确。而且尾鳍或鳞片中的纤维结构、骨质层、取样重量、样品新鲜程度及保存方式均影响提取DNA质量。
[0005]因此亟需一种能够提取美洲鲥鱼中高质量DNA的方法，并进而获得更多的性别鉴定的分子标记。

技术实现思路

[0006]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种美洲鲥鱼肌肉组织DNA提取方法，该方法通过对肌肉组织进行固定化和冷冻的方式进行预处理，进而获得完整而且高质量的DNA模板。本专利技术中模板DNA的质量直接影响鉴定结果，用高质量DNA可避免PCR反应中出现假阴性，同时提高实验的敏感性和特异性。最后通过采用不同浓度的引物及DNA验
证，增加实验准确性。
[0007]本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种美洲鲥鱼性别相关的分子标记的获得方法。
[0008]本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种美洲鲥鱼性别相关的分子标记的基因片段的获得方法。
[0009]本专利技术还要解决的技术问题是提供了按照分子标记的获得方法获得的美洲鲥鱼性别相关的分子标记以及按照基因片段的获得方法获得的美洲鲥鱼性别相关的分子标记的基因片段。
[0010]本专利技术还要解决的技术问题是提供了用于检测所述的美洲鲥鱼性别相关的分子标记或所述的基因片段的特异性引物对及其试剂盒。
[0011]本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种鉴别美洲鲥鱼性别的DNA标记方法。
[0012]技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种美洲鲥鱼肌肉组织DNA提取方法，所述肌肉组织DNA提取方法包括对肌肉组织进行预处理，所述预处理包括将50％酒精或20％甲醛对美洲鲥鱼的肌肉组织进行固定处理然后放入
‑
20℃或
‑
80℃冷冻处理。
[0013]本
技术实现思路
还包括一种美洲鲥鱼性别相关的分子标记的获得方法，所述方法采用所述的提取方法分别提取雄性美洲鲥鱼和雌性美洲鲥鱼的肌肉组织DNA，然后通过简化基因组方法测序获得美洲鲥鱼性别相关分子标记。
[0014]本
技术实现思路
还包括一种美洲鲥鱼性别相关的分子标记的基因片段的获得方法，所述获得方法包括将分子标记的获得方法获得的分子标记与NCBI数据库中的雄鲥鱼组装基因组序列进行比对，获得美洲鲥鱼性别相关的分子标记的基因片段的碱基序列。
[0015]按照分子标记的获得方法获得的美洲鲥鱼性别相关的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示。
[0016]按照基因片段的获得方法获得的美洲鲥鱼性别相关的分子标记的基因片段的碱基序列如SEQ ID NO：6或7或8或9或10所示。
[0017]用于检测所述的美洲鲥鱼性别相关的分子标记或所述的基因片段的特异性引物对，所述特异性引物对序列分别如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示。
[0018]本
技术实现思路
还包括所述的特异性引物对在制备鉴定美洲鲥鱼的遗传性别的试剂盒中的应用。
[0019]本
技术实现思路
还包括一种鉴定美洲鲥鱼的遗传性别的试剂盒，所述试剂盒包括所述的特异性引物对。
[0020]本
技术实现思路
还包括一种鉴别美洲鲥鱼性别的DNA标记方法，所述方法包括如下步骤：
[0021](1)提取未知性别的美洲鲥鱼的肌肉组织中的DNA；
[0022](2)采用所述的特异性引物对或所述的试剂盒进行PCR扩增；
[0023](3)当PCR扩增产物显示350bp、463bp、430bp、170bp或185bp条带时，即可判断为雄性美洲鲥鱼；当PCR扩增产物未发现有350bp、463bp、430bp、170bp或185bp条带时，即可判断为雌性美洲鲥鱼。
[0024]其中，所述PCR扩增体系包括：2
×
Taq Plus Master Mix I Dye Plus、权利要求6所述的特异性引物对、DNA、水；PCR反应条件如下：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1min，72℃终延伸5min。
[0025]本专利技术首先分别利用已知雌雄的多条美洲鲥鱼为样本，取肌肉组织提取总DNA，按照简化基因组方法进行测序文库构建，测序文库检验合格之后上机进行测序；对测序下机产生的FASTQ格式的原始数据(Raw data)进行过滤之后得到纯净数据(clean data)，使用Stacks软件包中的ustacks软件(version 1.34)进行聚类，构建参考序列。使用SOAP软件(version 2.21)将测序数据比对到参考序列，利用最大似然法(ML)进行位点的分型。最后获得五个雄性美洲鲥鱼特异的短序列，此序列在雄鲥鱼中均存在，但是在雌鲥鱼本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种美洲鲥鱼肌肉组织DNA提取方法，其特征在于，所述肌肉组织DNA提取方法包括对肌肉组织进行预处理，所述预处理包括将50%酒精或20%甲醛对美洲鲥鱼的肌肉组织进行固定处理然后放入
‑
20℃或
‑
80℃冷冻处理。2.一种美洲鲥鱼性别相关的分子标记的获得方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1所述的提取方法分别提取雄性美洲鲥鱼和雌性美洲鲥鱼的肌肉组织DNA，然后通过简化基因组方法测序获得美洲鲥鱼性别相关分子标记。3.一种美洲鲥鱼性别相关的分子标记的基因片段的获得方法，其特征在于，所述获得方法包括将权利要求2的方法获得的分子标记与NCBI数据库中的雄鲥鱼组装基因组序列进行比对，获得美洲鲥鱼性别相关的分子标记的基因片段的碱基序列。4.按照权利要求2的方法获得的美洲鲥鱼性别相关的分子标记，所述美洲鲥鱼性别相关的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或 SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示。5.按照权利要求3的方法获得的美洲鲥鱼性别相关的分子标记的基因片段，其特征在于，所述基因片段的碱基序列如SEQ ID NO：6或7或8或9或10所示。6.用于检测权利要求4所的美洲鲥鱼性别相关的分子标记或权利要求5所述的基因片段的特异性引物对，其特征在于，所述特异性引物对序列分别如SEQ ID NO：1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜佳，刘青华，
申请(专利权)人：苏州鱼之源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：