小片段DNA的检测方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了小片段DNA的检测方法及检测试剂盒，属于基因检测技术领域。所述检测方法为：(1)针对目标检测基因，设计得到特异性正向引物、特异性反向引物和探针；在特异性的正向引物的5

Detection method and detection kit of small fragment DNA

【技术实现步骤摘要】
小片段DNA的检测方法及检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种小片段DNA的检测方法及检测试剂盒，属于基因检测


技术介绍

[0002]实时荧光定量PCR(Real
‑
Time Polymerase Chain Reaction，qPCR)是能够定量监测目的基因扩增数量的PCR技术，其原理是在PCR体系中加入荧光染料或荧光分子标记的寡核苷酸链，与PCR扩增产物结合时荧光分子在紫外线的激发下发出荧光，通过荧光信号探测器直接检测反应体系中荧光信号的变化，检测监测目的基因的拷贝数量，并据此推断目的基因的初始量。
[0003]TaqMan探针是当前使用最广泛的水解荧光探针，其5'端标记了荧光发射分子，3'端标记了荧光淬灭分子，当TaqMan水解探针处于游离状态时，两端的荧光分子相互靠近，在紫外线的激发下荧光被吸收，无法被荧光探测器检测到。随着PCR反应的进行，TaqMan探针与目的基因发生特异性结合，5'端的荧光发射分子被DNA合成酶水解，在空间上脱离了荧光受体分子的影响，在紫外线的激发下产生荧光，并被荧光信号探测器所捕获。通过绝对定量或相对定量的方式对样本核酸量和扩增片段数量进行定量估计。
[0004]近年来出现了在TaqMan探针的3'或5'端连接MGB配体以提高探针灵敏度和特异度的方法。MGB(Minor groove binding)配体是一种三肽分子，能选择性地与富含AT两种碱基的双链DNA螺旋小沟发生非共价结合。MGB探针的一端以非荧光淬灭分子代替荧光淬灭分子，减少了背景荧光信号强度。MGB探针与靶基因的结合更加稳定,MGB能提高探针的Tm(MeltingTemperature，熔融温度)值，因此能够将探针设计地更短，有利于针对病毒的多种基因型的相同位点而设计通用探针；同时使探针能够分辨一个碱基的差别，当存在一个碱基不同时就无法在一定波长紫外线的激发下发出荧光，因此能够进行基因点突变的检测；MGB探针发生错配的概率更小，减少了非特异性扩增产物的出现。但是，若检测的目标片段过小(小于200bp)，则目标片段的引物设计无法在常规引物和双标记Taqman探针设计软件实现，无法在常规的PCR或者QPCR实验中完成。
[0005]SRY基因是雄性的性别决定基因，指Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段。人的SRY基因位于Yp11.3，只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约1.1kb，编码一个204氨基酸的蛋白质。SRY基因是目前认为的唯一一个性别决定基因，可以在血液、精液样本中寻找该基因片断以判断测试者性别，通常采用的方法是，先使用PCR技术扩增该基因上某个片断，再利用凝胶电泳判断样本中是否含有该基因，若测试者是男性，样本中存在该基因，
[0006]测试为阳性，女性测试者将会相应得到阴性结果。目前，SRY基因检测对医学、遗传学、优生学、动物育种学、法医学等领域的研究和应用都具有重要意义。

技术实现思路

[0007]针对上述现有技术，本专利技术提供了一种小片段DNA的检测方法，以及检测试剂盒，
特异性强，可以快速、准确地检测40～200bp的小片段DNA(例如陈旧样本中由于细胞凋亡而降解产生的游离DNA)，尤其是人SRY基因的小片段DNA。
[0008]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0009]一种小片段DNA的检测方法，包括以下步骤：
[0010](1)引物和探针的设计：针对目标检测基因，利用软件设计得到特异性正向引物(在本文中简称正向引物3)、特异性反向引物(在本文中简称反向引物2)和探针；
[0011]在特异性的正向引物的5
’
端连接一段含有延伸阻滞剂的茎环结构得到茎环引物(在本文中简称正向引物1)，所述含有延伸阻滞剂的茎环结构的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述延伸阻滞剂为甲基化的CpG结构，SEQ ID NO.1中下划线部分为甲基化的CpG结构，该结构中的胞嘧啶为5－甲基胞嘧啶(5
‑
mC)；即SEQ ID NO.1中第11、13、15位的碱基为5－甲基胞嘧啶；
[0012]SEQ ID NO.1：5
’‑
AGCCATCCAGCGCGCGGCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCT
‑3’
；
[0013]所述探针的5
’
端连接荧光基团，3
’
端连接淬灭基团BHQ。
[0014](2)QPCR检测：提取待检测样品中的小片段DNA，利用步骤(1)中设计得到的引物和探针，利用QPCR检测方法进行扩增和检测，根据检测结果，判断待检测样品中是否含有目标检测基因。
[0015]进一步地，所述目标检测基因为人SRY基因。
[0016]更进一步地，针对人SRY基因，所述茎环引物、特异性正向引物、特异性反向引物和探针的核苷酸序列如下所示，如SEQ ID NO.2～5所示，其所针对的是40bp的小片段DNA。
[0017]SEQ ID NO.2：
[0018]5’‑
AGCCATCCAGCGCGCGGCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCTTCCAGGATAGAGTGAAGCGACCCA
‑3’
。
[0019]SEQ ID NO.3：5
’‑
CACACGATGAATGCGT
‑3’
。
[0020]SEQ ID NO.4：5
’‑
TCCAGGATAGAGTGAAGCGACCCA
‑3’
。
[0021]SEQ ID NO.5：5
’‑
TAGAGTGAAGC
‑3’
。
[0022]更进一步地，针对人SRY基因，所述茎环引物、特异性正向引物、特异性反向引物和探针的核苷酸序列如下所示，如SEQ ID NO.6～9所示，其所针对的是62bp的小片段DNA。
[0023]SEQ ID NO.6：
[0024]5’‑
AGCCATCCAGCGCGCGGCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCTAGAGTGAAGCGACCCATGA
‑3’
。
[0025]SEQ ID NO.7：5
’‑
GCCATCTTGCGCCTC
‑3’
。
[0026]SEQ ID NO.8：5
’‑
AGAGTGAAGCGACCCATGA
‑3’
。
[0027]SEQ ID NO.9：5
’‑
TCGTGTGGTCTCG
‑3’
。
[0028]更进一步地，针对人SRY基因，所述茎环引物、特异性正向引物、特异性反向引物和探针的核苷酸序列如下所示，如SEQ ID NO.10～13所示，其所针对的是84bp的小片段DNA。
[0029]SEQ ID NO.10：<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小片段DNA的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)引物和探针的设计：针对目标检测基因，设计得到特异性正向引物、特异性反向引物和探针；在特异性的正向引物的5
’
端连接一段含有延伸阻滞剂的茎环结构得到茎环引物，所述含有延伸阻滞剂的茎环结构的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第11、13、15位的碱基为5－甲基胞嘧啶；SEQ ID NO.1：5
’‑
AGCCATCCAGCGCGCGGCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCT
‑3’
；所述探针的5
’
端连接荧光基团，3
’
端连接淬灭基团BHQ；(2)QPCR检测：提取待检测样品中的小片段DNA，利用步骤(1)中设计得到的引物和探针，利用QPCR检测方法进行扩增和检测，根据检测结果，判断待检测样品中是否含有目标检测基因。2.根据权利要求1所述的小片段DNA的检测方法，其特征在于：所述目标检测基因为人SRY基因；所述茎环引物、特异性正向引物、特异性反向引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～5所示，其所针对的是40bp的小片段DNA；SEQ ID NO.2：5
’‑
AGCCATCCAGCGCGCGGCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCTTCCAGGATAGAGTGAAGCGACCCA
‑3’
；SEQ ID NO.3：5
’‑
CACACGATGAATGCGT
‑3’
；SEQ ID NO.4：5
’‑
TCCAGGATAGAGTGAAGCGACCCA
‑3’
；SEQ ID NO.5：5
’‑
TAGAGTGAAGC
‑3’
。3.根据权利要求1所述的小片段DNA的检测方法，其特征在于：所述目标检测基因为人SRY基因；所述茎环引物、特异性正向引物、特异性反向引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6～9所示，其所针对的是62bp的小片段DNA；SEQ ID NO.6：5
’‑
AGCCATCCAGCGCGCGGCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCTAGAGTGAAGCGACCCATGA
‑3’
；SEQ ID NO.7：5
’‑
GCCATCTTGCGCCTC
‑3’
；SEQ ID NO.8：5
’‑
AGAGTGAAGCGACCCATGA
‑3’
；SEQ ID NO.9：5
’‑
TCGTGTGGTCTCG
‑3’
。4.根据权利要求1所述的小片段DNA的检测方法，其特征在于：所述目标检测基因为人SRY基因；所述茎环引物、特异性正向引物、特异性反向引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10～13所示，其所针对的是84bp的小片段DNA；SEQ ID NO.10：5
’‑
AGCCATCCAGCGCGCGGCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCTTGGATAGTAAAATAAGTTTCG
‑3’
；SEQ ID NO.11：5
’‑
GAAGCATATGATTGCATTG
‑3’
；SEQ ID NO.12：5
’‑
TGGATAGTAAAATAAGTTTCG
‑3’
；SEQ ID NO.13：5
’‑
GCACCTTTCAATTTTGTCG
‑3’
。5.根据权利要求1所述的小片段DNA的检测方法，其特征在于：所述待检测样品为血浆样本。6.根据权利要求1所述的小片段DNA的检测方法，其特征在于：所述QPCR检测的反应体系为：2x iTaq Probe ...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵佳，王建春，赵艳秋，陈为鑫，
申请(专利权)人：深圳市萨米医疗中心，
类型：发明
国别省市：