通过巯基偶联物增加抗体蛋白标记效率及稳定性的标记方法技术

本发明专利技术公开了一种通过巯基偶联物增加抗体蛋白标记效率及稳定性的标记方法，取待标记蛋白溶液与含巯基试剂溶液混合反应得巯基偶联蛋白溶液，然后加入胶体金溶液中，反应20～120分钟后，加入封闭剂进行封闭反应后得胶体金标记蛋白复合物。本发明专利技术通过对标记蛋白的预处理，使其巯基化，通过金硫键使标记蛋白更稳定的结合于胶体金颗粒上，提高胶体金与蛋白质结合的稳定性。结合的稳定性。

【技术实现步骤摘要】
通过巯基偶联物增加抗体蛋白标记效率及稳定性的标记方法


[0001]本专利技术涉及免疫金标记方法，具体地涉及一种通过巯基偶联物增加抗体蛋白标记效率及稳定性的标记方法。

技术介绍

[0002]免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种免疫标记技术，胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。胶体金标记蛋白质的原理，一般认为是由于 pH值等于或稍偏碱于蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，较易吸附于金颗粒的表面，由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态，如果等电点低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体金带负电荷，二者极易静电结合形成大的聚合物。
[0003]现有技术的缺陷或不足：胶体金通过静电吸附与蛋白质结合，抗原/抗体容易从金颗粒表面脱离，标记物稳定性较差；此外，通过物理吸附与蛋白的结合，其标记效率较低，导致胶体金产品普遍灵敏度较低。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种通过巯基偶联物增加抗体蛋白标记效率及稳定性的标记方法，通过对标记蛋白的预处理，使其巯基化，通过金硫键使标记蛋白更稳定的结合于胶体金颗粒上，提高胶体金与蛋白质结合的稳定性。
[0005]本专利技术通过以下技术方案实现：一种通过巯基偶联物增加抗体蛋白标记效率及稳定性的标记方法，取待标记蛋白溶液与含巯基试剂溶液混合反应得巯基偶联蛋白溶液，然后加入胶体金溶液中，反应20～120分钟后，加入封闭剂进行封闭反应后得胶体金标记蛋白复合物。
[0006]所述含巯基试剂溶液的浓度为2～10mg/mL，溶剂为缓冲液。所述含巯基试剂可以是2
‑
亚氨基硫烷盐酸盐(Traut
’
s Regent)或硫辛酸。
[0007]所述待标记蛋白溶液浓度为1mg/mL，溶剂为缓冲液。待标记蛋白溶液浓度为1mg/mL，其pH为7～9，适于巯基化反应，尤其适于2
‑
亚氨基硫烷盐酸盐(Traut
’
s Regent)的巯基化反应。
[0008]所述的缓冲液可以是PBS、硼酸、MOPS等。
[0009]所述巯基偶联蛋白质溶液以待标记蛋白浓度为2～100mg/mL的量加入到胶体金溶液中。
[0010]所述封闭剂为牛血清蛋白(BSA)、酪蛋白(Casein)、脱脂奶粉等。
[0011]与现有技术相比，本专利技术具有的有益效果为：
[0012]1.本专利技术通过含巯基的试剂对待标记蛋白的处理，使蛋白表面巯基化，蛋白表面的巯基与胶体金通过金硫键结合，形成更稳定的金标结合物，能大幅度提高胶体金产品的标记效率，提高产品的灵敏度和稳定性。在胶体金诊断试剂的研发和生产过程中，具有较高的实用意义，适于广泛推广应用。
具体实施方式
[0013]下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本专利技术，本专利技术的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本专利技术，而非限制本专利技术。
[0014]实施例一Traut
’
s试剂标记抗体
[0015]1.标记抗体的稀释：用0.05M的PBS(pH 7.4)将标记抗体稀释到终浓度1mg/mL。
[0016]2.Traut
’
s试剂的溶解：用0.05M的PBS(pH 7.4)将Traut
’
s试剂溶解成终浓度为5mg/ mL的溶液。
[0017]3.标记蛋白的处理：将标记蛋白与Traut
’
s试剂按照最终摩尔比1:20的比例，反应120 分钟，得巯基偶联蛋白溶液。
[0018]4.处理后蛋白的标记：将胶体金溶液调整至合适pH，随后将巯基偶联蛋白溶液按标记蛋白终浓度5mg/mL的量加入到胶体金溶液中，振荡反应30分钟后，加入终浓度为1％的B SA，进行30分钟振荡封闭。封闭反应结束后，在离心力4660xg下，离心，去除上清后加入原体积十分之一的胶体金复溶液，复溶胶体金标记复合物。胶体金复溶液的配方含有：Tris缓冲液、BSA、糖类、表面活性剂以及防腐剂。
[0019]实施例二Traut
’
s试剂标记抗体
[0020]与实施例一不同的是：
[0021]1.标记抗体的稀释：用0.1M的硼酸缓冲液(pH 8.0)将标记抗体稀释到终浓度1mg/mL。
[0022]2.Traut
’
s试剂的溶解：用0.1M的硼酸缓冲液(pH 8.0)将Traut
’
s试剂溶解成终浓度为 5mg/mL的溶液。
[0023]实施例三Traut
’
s试剂标记抗原
[0024]1.标记抗原的稀释：用0.1M的硼酸缓冲液(pH 8.0)将标记抗原稀释到终浓度1mg/mL。
[0025]2.标记抗原的处理：将标记抗原与Traut
’
s试剂按照最终摩尔比1:30的比例，处理120 分钟，得巯基偶联蛋白溶液。
[0026]3.处理后抗原的标记：将胶体金溶液调整至合适pH，随后将巯基偶联蛋白溶液按标记抗原终浓度为20mg/mL的量加入到胶体金溶液中，振荡反应30分钟后，加入终浓度为1％的封闭剂BSA，进行30分钟振荡封闭。封闭反应结束后，在离心力4660xg下,离心，去除上清后加入原体积十分之一的胶体金复溶液，复溶胶体金标记复合物。
[0027]实施例四硫辛酸标记抗体
[0028]1.标记抗体的稀释：用0.05M的PBS(pH 7.4)将标记抗体稀释到终浓度1mg/mL。
[0029]2.硫辛酸的溶解：用0.05M的PBS(pH 7.4)将硫辛酸溶解成终浓度为5mg/mL的溶液。
[0030]3.标记抗体的处理：将标记抗体与硫辛酸按照最终摩尔比1:20的比例，处理120分钟，得巯基偶联蛋白溶液。
[0031]4.处理后抗体的标记：将胶体金溶液调整至合适pH，随后将巯基偶联蛋白溶液按标记抗体终浓度为5mg/mL的量加入到胶体金溶液中，振荡反应30分钟后，加入终浓度为1％的封闭剂BSA，振荡30分钟封闭。封闭反应结束后，在离心力4660xg下,离心，去除上清后加入原体积十分之一的胶体金复溶液，复溶胶体金标记复合物。
[0032]实施例五硫辛酸标记抗体
[0033]1.标记抗体的稀释：用0.1M的硼酸缓冲液(pH 8.0)将标记抗体稀释到终浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过巯基偶联物增加抗体蛋白标记效率及稳定性的标记方法，其特征是，取待标记蛋白溶液与含巯基试剂溶液混合反应得巯基偶联蛋白溶液，然后加入胶体金溶液中，反应20～120分钟后，加入封闭剂进行封闭反应后得胶体金标记蛋白复合物。2.根据权利要求1所述的通过巯基偶联物增加抗体蛋白标记效率及稳定性的标记方法，其特征是，所述含巯基试剂溶液的浓度为2～10mg/mL，溶剂为缓冲液。3.根据权利要求2所述的通过巯基偶联物增加抗体蛋白标记效率及稳定性的标记方法，其特征是，所述含巯基试剂为2
‑
亚氨基硫烷盐酸盐或硫辛酸。4.根据权利要求1所述的通过巯基偶联物增加...

【专利技术属性】
技术研发人员：董亚玲，王佳，
申请(专利权)人：郑州凌思生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：