【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于单细胞分泌组学的方法和组合物
[0001]相关申请
[0002]本申请根据35 U.S.C.
§
119(e)要求2020年1月17日提交的美国临时专利申请序列第62/962927号的权益，为了所有目的此相关申请的内容通过引用以其整体并入本文。
[0003]对序列表的引用
[0004]本申请连同电子格式的序列表一起提交。序列表被提供为题为SeqListing_68EB_298724_WO的文件，创建于2021年1月14日，大小是4千字节。电子格式的序列表的信息通过引用以其整体并入本文。
[0005]背景
[0006]领域
[0007]本公开内容总体上涉及分子生物学领域，例如使用分子条形码化来鉴定不同样品的细胞并确定细胞的分泌分子谱。
[0008]对相关技术的描述
[0009]当前的技术允许在每个细胞与条形码化试剂珠在隔室(compartment)中共定位时通过将细胞特异性寡核苷酸条形码附接至来自个体细胞的多(A)mRNA分子而以大规模并行的方式(例如，>10000个细胞)测量单细胞的基因表达。基因表达可能影响蛋白表达和分子的分泌。蛋白
‑
蛋白相互作用可能影响细胞的基因表达和蛋白表达以及分子的分泌。细胞释放的细胞因子和其他分子是免疫学家和其他细胞生物学家非常感兴趣的。用于检测和测量分泌蛋白的传统方法通常是批量测量(而不是在单细胞水平)。例如，当前可用的方法包括用于批量研究分泌因子的基于珠的测定和ELISA。因此，数据中缺少单细胞定量和细胞...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于测量由细胞分泌的分泌因子的拷贝数的方法，所述方法包括：使多于一种双特异性探针与包含表面细胞靶的多于一个细胞接触以形成与所述双特异性探针关联的多于一个细胞，其中所述多于一个细胞能够分泌多于一种分泌因子，其中所述双特异性探针包含锚定探针和捕获探针，其中所述锚定探针能够与所述表面细胞靶特异性结合，并且其中所述捕获探针能够与由与所述捕获探针关联的所述多于一个细胞中的一个分泌的所述多于一种分泌因子中的至少一种特异性结合；使与所述双特异性探针关联的所述多于一个细胞与能够与被捕获探针结合的分泌因子特异性结合的多于一种分泌因子结合试剂接触，其中所述多于一种分泌因子结合试剂中的每一种包含分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸，所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸包含用于所述分泌因子结合试剂的独特因子标识符序列；使多于一种寡核苷酸条形码与所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸接触进行杂交，其中所述寡核苷酸条形码各自包含第一分子标记；使与所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一种条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸，所述多于一种条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸各自包含与所述独特因子标识符序列的至少一部分互补的序列和所述第一分子标记；以及获得所述多于一种条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列信息，以确定由所述多于一个细胞中的一个或更多个分泌的所述多于一种分泌因子中的至少一种分泌因子的拷贝数。2.一种用于测量由细胞分泌的分泌因子的拷贝数和细胞中核酸靶的拷贝数的方法，所述方法包括：使多于一种双特异性探针与包含表面细胞靶和核酸靶的拷贝的多于一个细胞接触以形成与所述双特异性探针关联的多于一个细胞，其中所述多于一个细胞能够分泌多于一种分泌因子，其中所述双特异性探针包含锚定探针和捕获探针，其中所述锚定探针能够与所述表面细胞靶特异性结合，并且其中所述捕获探针能够与由与所述捕获探针关联的所述多于一个细胞中的一个分泌的所述多于一种分泌因子中的至少一种特异性结合；使与所述双特异性探针关联的所述多于一个细胞与能够与被捕获探针结合的分泌因子特异性结合的多于一种分泌因子结合试剂接触，其中所述多于一种分泌因子结合试剂中的每一种包含分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸，所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸包含用于所述分泌因子结合试剂的独特因子标识符序列；使多于一种寡核苷酸条形码与所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸和所述核酸靶的拷贝接触进行杂交，其中所述寡核苷酸条形码各自包含第一分子标记；使与所述核酸靶的拷贝杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一种条形码化核酸分子，所述多于一种条形码化核酸分子各自包含与所述核酸靶的至少一部分互补的序列和所述第一分子标记；使与所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一种条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸，所述多于一种条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸各自包含与所述独特因子标识符序列的至少一部分互补的序列和所述第一分子标记；
获得所述多于一种条形码化核酸分子或其产物的序列信息，以确定所述多于一个细胞中的一个或更多个中所述核酸靶的拷贝数；以及获得所述多于一种条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列信息，以确定由所述多于一个细胞中的一个或更多个分泌的所述多于一种分泌因子中的至少一种分泌因子的拷贝数。3.一种用于测量由细胞分泌的分泌因子的拷贝数和测量细胞中细胞组分表达的方法，所述方法包括：使多于一种双特异性探针与包含表面细胞靶和多于一种细胞组分靶的多于一个细胞接触以形成与所述双特异性探针关联的多于一个细胞，其中所述多于一个细胞能够分泌多于一种分泌因子，其中所述双特异性探针包含锚定探针和捕获探针，其中所述锚定探针能够与所述表面细胞靶特异性结合，并且其中所述捕获探针能够与由与所述捕获探针关联的所述多于一个细胞中的一个分泌的所述多于一种分泌因子中的至少一种特异性结合；使与所述双特异性探针关联的所述多于一个细胞与能够与被捕获探针结合的分泌因子特异性结合的多于一种分泌因子结合试剂接触，其中所述多于一种分泌因子结合试剂中的每一种包含分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸，所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸包含用于所述分泌因子结合试剂的独特因子标识符序列；使多于一种细胞组分结合试剂与和所述双特异性探针和所述分泌因子结合试剂关联的多于一个细胞接触，其中所述多于一种细胞组分结合试剂中的每一种包含细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸，所述细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含用于所述细胞组分结合试剂的独特标识符序列，并且其中所述细胞组分结合试剂能够与所述多于一种细胞组分靶中的至少一种特异性结合；使多于一种寡核苷酸条形码与所述细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸和所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸接触进行杂交，其中所述寡核苷酸条形码各自包含第一分子标记；使与所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一种条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸，所述多于一种条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸各自包含与所述独特因子标识符序列的至少一部分互补的序列和所述第一分子标记；使与所述细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一种条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸，所述多于一种条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸各自包含与所述独特标识符序列的至少一部分互补的序列和所述第一分子标记；获得所述多于一种条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列信息，以确定所述多于一个细胞中的一个或更多个中所述多于一种细胞组分靶中的至少一种细胞组分靶的拷贝数；以及获得所述多于一种条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列信息，以确定所述多于一个细胞中的一个或更多个中所述多于一种分泌因子中的至少一种分泌因子的拷贝数。4.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括在使与所述分泌因子结合试剂特异性寡
核苷酸杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸之前：将与所述双特异性探针和所述分泌因子结合试剂关联的多于一个细胞分区到多于一个分区，其中所述多于一个分区中的分区包含来自与所述双特异性探针和所述分泌因子结合试剂关联的多于一个细胞的单细胞；在包含所述单细胞的分区中，使多于一种寡核苷酸条形码与所述细胞因子结合试剂特异性寡核苷酸接触进行杂交。5.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括在使与所述核酸靶的拷贝杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸之前和在使与所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸之前：将与所述双特异性探针和所述分泌因子结合试剂关联的多于一个细胞分区到多于一个分区，其中所述多于一个分区中的分区包含来自与所述双特异性探针和所述分泌因子结合试剂关联的多于一个细胞的单细胞；在包含所述单细胞的分区中，使多于一种寡核苷酸条形码与所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸和所述核酸靶的拷贝接触进行杂交。6.根据权利要求3所述的方法，所述方法包括在使与细胞组分结合试剂寡核苷酸杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸之前和在使与所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸杂交的所述多于一种寡核苷酸条形码延伸之前：将与所述双特异性探针和所述分泌因子结合试剂和所述多于一种细胞组分结合试剂关联的多于一个细胞分区到多于一个分区，其中所述多于一个分区中的分区包含来自与所述双特异性探针和所述分泌因子结合试剂和所述多于一种细胞组分结合试剂关联的多于一个细胞的单细胞；在包含所述单细胞的分区中，使多于一种寡核苷酸条形码与所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸和所述细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸接触进行杂交。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸条形码与固体支持物关联，并且其中所述多于一个分区中的分区包含单个固体支持物，任选地所述分区是孔或液滴。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中每一种寡核苷酸条形码包含第一通用序列。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸条形码包含靶结合区，所述靶结合区包括捕获序列，任选地所述靶结合区包含多(dT)区。10.根据权利要求3
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9中任一项所述的方法，其中所述细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含与所述捕获序列互补的序列，所述捕获序列被配置为捕获所述细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸；并且任选地与所述捕获序列互补的序列包括多(dA)区。11.根据权利要求1
‑
10中任一项所述的方法，其中所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸包含与所述捕获序列互补的序列，所述捕获序列被配置为捕获所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸；并且任选地与所述捕获序列互补的序列包括多(dA)区。12.根据权利要求1
‑
11中任一项所述的方法，其中所述多于一种条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸包含所述第一通用序列的互补体。13.根据权利要求1
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12中任一项所述的方法，其中所述分泌因子结合试剂特异性寡核
苷酸包含第二通用序列。14.根据权利要求1
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13中任一项所述的方法，其中获得所述多于一种条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列信息包括：使用能够与所述第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与所述第二通用序列或其互补体杂交的引物，扩增所述多于一种条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸或其产物，以产生多于一种扩增的条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸；以及获得所述多于一种扩增的条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的测序数据。15.根据权利要求1
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14中任一项所述的方法，其中所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸包含第二分子标记，任选地所述多于一种分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸中的至少10种包含不同的第二分子标记序列。16.根据权利要求15所述的方法，其中：(i)至少两种分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸的第二分子标记序列是不同的，并且其中所述至少两种分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸的独特标识符序列是相同的；或者(ii)至少两种分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸的第二分子标记序列是不同的，并且其中所述至少两种分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸的独特标识符序列是不同的。17.根据权利要求1
‑
16中任一项所述的方法，其中所述测序数据中与用于所述分泌因子结合试剂的独特因子标识符序列关联的独特第一分子标记序列的数目指示由所述多于一个细胞中的一个或更多个分泌的所述多于一种分泌因子中的至少一种分泌因子的拷贝数，所述分泌因子结合试剂能够与所述多于一种分泌因子中的至少一种分泌因子特异性结合。18.根据权利要求15
‑
17中任一项所述的方法，其中所述测序数据中与用于所述分泌因子结合试剂的独特因子标识符序列关联的独特第二分子标记序列的数目指示由所述多于一个细胞中的一个或更多个分泌的所述多于一种分泌因子中的至少一种分泌因子的拷贝数，所述分泌因子结合试剂能够与所述多于一种分泌因子中的至少一种分泌因子特异性结合。19.根据权利要求1
‑
18中任一项所述的方法，其中获得所述序列信息包括将测序衔接子附接到所述多于一种条形码化分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸或其产物。20.根据权利要求1
‑
19中任一项所述的方法，其中所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸包含与所述多(dA)区相邻的对齐序列。21.根据权利要求1
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20中任一项所述的方法，其中所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸：(i)通过接头与所述分泌因子结合试剂关联；和/或(ii)被配置成可从所述分泌因子结合试剂脱离。22.根据权利要求1
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21中任一项所述的方法，所述方法包括使所述分泌因子结合试剂特异性寡核苷酸与所述分泌因子结合试剂解离。23.根据权利要求1
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22中任一项所述的方法，所述方法包括在使多于一种双特异性探针与多于一个细胞接触之后，去除所述多于一种双特异性探针中未与所述多于一个细胞接触的一种或更多种双特异性探针；任选地去除未与所述多于一个细胞接触的一种或更多种双特异性探针包括：去除未与所述表面细胞靶中对应的至少一种接触的一种或更多种双特
异性探针。24.根据权利要求1
‑
23中任一项所述的方法，所述方法包括在使与所述双特异性探针关联的所述多于一个细胞与多于一种分泌因子结合试剂接触之后，去除所述多于一种分泌因子结合试剂中未与所述多于一个细胞接触的一种或更多种分泌因子结合试剂；任选地去除未与所述多于一个细胞接触的一种或更多种分泌因子结合试剂包括：去除未与被捕获探针结合的所述分泌因子中对应的至少一种接触的一种或更多种分泌因子结合试剂。25.根据权利要求2
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24中任一项所述的方法，其中确定所述多于一个细胞中的一个或更多个中所述核酸靶的拷贝数包括基于与所述多于一种条形码化核酸分子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记、其互补体或其组合的数目来确定所述多于一个细胞中所述核酸靶的拷贝数。26.根据权利要求2
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25中任一项所述的方法，所述方法包括：使随机引物与所述多于一种条形码化核酸分子接触，其中所述随机引物中的每一种包含第三通用序列或其互补体；使与所述多于一种条形码化核酸分子杂交的所述随机引物延伸以产生多于一种延伸产物；以及任选地使用能够与所述第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与所述第三通用序列或其互补体杂交的引物来扩增所述多于一种延伸产物，从而产生第一多于一种条形码化扩增子；并且其中扩增所述多于一种延伸产物任选地包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到所述多于一种延伸产物。27.根据权利要求26所述的方法，所述方法包括基于与所述第一多于一种条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记的数目来确定所述多于一个细胞中的一个或更多个中所述核酸靶的拷贝数。28.根据权利要求26或27所述的方法，其中确定所述多于一个细胞中的一个或更多个中所述核酸靶的拷贝数包括基于与包含所述多于一种核酸靶中的每一种的序列的所述第一多于一种条形码化扩增子关联的具有不同序列的所述第一分子标记的数目来确定所述多于一个细胞中的一个或更多个中所述多于一种核酸靶中的每一种的数目，任选地所述多于一种核酸靶中的每一种的序列包括所述多于一种核酸靶中的每一种的子序列。29.根据权利要求26
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28中任一项所述的方法，其中所述第一多于一种条形码化扩增子中所述核酸靶的序列包括所述核酸靶的子序列。30.根据权利要求26
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29中任一项所述的方法，所述方法包括使用能够与所述第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与所述第三通用序列或其互补体杂交的引物来扩增所述第一多于一种条形码化扩增子，从而产生第二多于一种条形码化扩增子；任选地其中扩增所述第一多于一种条形码化扩增子包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到所述第一多于一种条形码化扩增子。31.根据权利要求30所述的方法，所述方法包括基于与所述第二多于一种条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记的数目来确定所述多于一个细胞中的一个或更多个中所述核酸靶的拷贝数。32.根据权利要求26
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31中任一项所述的方法，其中所述第一多于一种条形码化扩增子和/或所述第二多于一种条形码化扩增子包含全转录组扩增(WTA)产物。
33.根据权利要求2
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32中任一项所述的方法，所述方法包括使用所述多于一种条形码化核酸分子作为模板来合成第三多于一种条形码化扩增子以产生第三多于一种条形码化扩增子，其中合成第三多于一种条形码化扩增子任选地包括对所述多于一种条形码化核酸分子进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；并且任选地合成第三多于一种条形码化扩增子包括使用能够与所述第一通用序列或其互补体杂交的引物和靶特异性引物的PCR扩增。34.根据权利要求33中任一项所述的方法，所述方法包括获得所述第三多于一种条形码化扩增子或其产物的序列信息，并且任选地获得所述序列信息包括将测序衔接子附接到所述第三多于一种条形码化扩增子或其产物。35.根据权利要求33或34所述的方法，所述方法包括基于与所述第三多于一种条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记的数目来确定所述多于一个细胞中的一个或更多个中核酸靶的拷贝数。36.根据权利要求2
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35中任一项所述的方法，其中所述核酸靶包括核酸分子，并且任选地所述核酸分子包括核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、包含多(A)尾的RNA、样品索引寡核苷酸、细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其任何组合。37.根据权利要求3
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36中任一项所述的方法，其中所述多于一种条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含所述第一通用序列的互补体。38.根据权利要求3
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37中任一项所述的方法，其中所述细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含第三通用序列。39.根据权利要求3
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37中任一项所述的方法，其中获得所述多于一种条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列信息包括：使用能够与所述第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与所述第二通用序列或其互补体杂交的引物，扩增所述多于一种条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物，以产生多于一种扩增的条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸；以及获得所述多于一种扩增的条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的测序数据。40.根据权利要求3
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39中任一项所述的方法，其中所述细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含第三分子标记，任选地所述多于一种细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸中的至少10种包含不同的第三分子标记序列。41.根据权利要求40所述的方法，其中：(i)至少两种细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸的第三分子标记序列是不同的，并且其中所述至少两种细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸的独特标识符序列是相同的；或者(ii)至少两种细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸的第三分子标记序列是不同的，并且其中所述至少两种细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸的独特标识符序列是不同的。42.根据权利要求3
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41中任一项所述的方法，其中所述测序数据中与用于所述细胞组分结合试剂的独特标识符序列关联的独特第一分子标记序列的数目指示所述多于一个细胞中的一个或更多个中所述至少一种细胞组分靶的拷贝数，所述细胞组分结合试剂能够与所述至少一种细胞组分靶特异性结合。43.根据权利要求40
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42中任一项所述的方法，其中所述测序数据中与用于所述细胞组
分结合试剂的独特标识符序列关联的独特第三分子标记序列的数目指示所述多于一个细胞中的一个或更多个中所述至少一种细胞组分靶的拷贝数，所述细胞组分结合试剂能够与所述至少一种细胞组分靶特异性结合。44.根据权利要求3
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43中任一项所述的方法，其中获得所述序列信息包括将测序衔接子附接到所述多于一种条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物。45.根据权利要求3
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44中任一项所述的方法，其中所述细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含与所述多(dA)区相邻的对齐序列。46.根据权利要求3
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45中任一项所述的方法，其中所述细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸(i)通过接头与所述细胞组分结合试剂关联；和/或(ii)被配置成可从所述细胞组分结合试剂脱离。47.根据权利要求3
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46中任一项所述的方法，所述方法包括使所述细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸与所述细胞组分结合试剂解离。48.根据权利要求3
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47中任一项所述的方法，所述方法包括在使所述多于一种细胞组分结合试剂与所述多于一个细胞接触之后，去除所述多于一种细胞组分结合试剂中未与所述多于一个细胞接触的一种或更多种细胞组分结合试剂，并且任选地去除未与所述多于一个细胞接触的一种或更多种细胞组分结合试剂包括：去除未与所述多于一种细胞组分靶中对应的至少一种接触的一种或更多种细胞组分结合试剂。49.根据权利要求3
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48中任一项所述的方法，其中所述细胞组分靶包括碳水化合物、脂质、蛋白、细胞外蛋白、细胞表面蛋白、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、细胞内蛋白或其任何组合，任选地所述细胞组分靶在细胞表面上。50.根据权利要求1
‑
49中任一项所述的方法，其中使所述多于一种寡核苷酸条形码延伸包括使用逆转录酶和/或缺乏5
’
至3
’
核酸外切酶活性和3
’
至5
’
核酸外切酶活性中至少一种的DNA聚合酶使所述多于一种寡核苷酸条形码延伸；并且任选地所述DNA聚合酶包括Klenow片段，和/或所述逆转录酶包括病毒逆转录酶，任选地其中所述病毒逆转录酶是鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶。51.根据权利要求1
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50中任一项所述的方法，其中：(i)所述第一通用序列、所述第二通用序列和/或所述第三通用序列是相同的；和/或(ii)所述第一通用序列、所述第二通用序列和/或所述第三通用序列是不同的。52.根据权利要求1
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51中任一项所述的方法，其中所述第一通用序列、所述第二通用序列、所述第三通用序列包含测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分，任选地所述测序衔接子包括P5序列、P7序列、其互补序列和/或其部分，还任选地所述测序引物包括读段1测序引物、读段2测序引物、其互补序列和/或其部分。53.根据权利要求20
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52中任一项所述的方法，其中(a)所述对齐序列包含鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其组合；(b)所述对齐序列包含多(dT)序列、多(dG)序列、多(dC)序列、多(dU)序列或其组合；(c)所述对齐序列在所述多(dA)区的5
’
；和/或(d)所述对齐序列的长度为一个或更多个核苷酸，或长度为两个或更多个核苷酸。54.根据权利要求21
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53中任一项所述的方法，其中所述接头包含碳链，任选地所述碳链包含2
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30个碳原子，并且还任选地所述碳链包含12个碳原子，任选地所述接头包含5
’
氨
基修饰物C12(5AmMC12)或其衍生物。55.根据权利要求1
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54中任一项所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸条形码中的至少10种包含不同的第一分子标记序列。56.根据权利要求1
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55中任一项所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸条形码各自包括细胞标记，并且任选地所述多于一种寡核苷酸条形码的每一种细胞标记包含至少6个核苷酸，任选地与同一固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记，还任选地与不同固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记。57.根据权利要求7
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56中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包括合成颗粒或平坦表面，任选地所述固体支持物是可破坏的，还任选地所述合成颗粒包括可破坏的水凝胶颗粒。58.根据权利要求7
‑
57中任一项所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种被固定在所述固体支持物上、部分地固定在所述固体支持物上、包封在所述固体支持物中或部分地包封在所述固体支持物中。59.根据权利要求57
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58中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包括珠，并且任选地所述珠包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠...
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