一种测定血浆中SHP099浓度的方法技术

本发明专利技术公开了一种测定血浆(K2EDTA抗凝)中SHP099浓度的方法，包括如下步骤：采用蛋白沉淀的方法对血浆样品进行预处理，获得测试样品；将测试样品采用高效液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种测定血浆中SHP099浓度的方法


[0001]本专利技术涉及医药
，具体涉及一种药物的测定方法，特别涉及一种测定血浆(K2EDTA抗凝)中SHP099浓度的方法。

技术介绍

[0002]SHP099是一种有效的SHP2抑制剂，因其存在变构作用机制，使其在一个自抑制的构型中使SHP2稳定而无法产生活性。其化学名称6
‑
(4
‑
氨基
ꢀ‑4‑
甲基
‑1‑
哌啶基)
‑3‑
(2,3
‑
二氯苯基)
‑2‑
吡嗪胺，分子式：C
16
H
19
Cl2N5，分子量：352.3，其化学结构式为：
[0003][0004]SHP2为含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶，是一个关键的信号节点和调节因子，通过RAS通路促进癌细胞存活和生长，在癌细胞对靶向治疗产生耐药性的方式中发挥关键作用。过去几十年，它一直被认为是“不可成药”靶点。随着研究的深入发现了几种类型的小分子抑制剂。
[0005]磷酸酶作为一种在多种细胞信号通路中发挥重要作用的蛋白，几十年来，科学家们在磷酸酶上已经花费了无数时间，却难以开发出以它们为靶标的药物。其中SHP2(蛋白酪氨酸磷酸酶2)在许多癌症中都有涉及.
[0006]SHP2的全名叫做蛋白酪氨酸磷酸酶2，它与乳腺癌、白血病、肺癌、肝癌、胃癌、喉癌、口腔癌，以及其他多种癌症类型密切相关。SHP2一般由EGFR、FGFR2、HER2和ALK等酪氨酸激酶受体所驱动。这样的酪氨酸激酶受体有30％在人类的癌症细胞系中被改变。它们活化调节细胞生长和分化的MAPK分析信号途径。
[0007]SHP2的重要性在一个大型的基因敲除实验中被发现。在一个或多个酪氨酸激酶受体有改变的细胞中SHP2的降低让癌细胞几乎“残废”，也就是说癌细胞的生存依赖于SHP2。
[0008]SHP2就像一个铰链一样工作。当它打开时才有活性，并且我们能够将其保持关闭。所以研究团队开始将目光投向SHP2不同的构象，琢磨它的铰链结构。
[0009]很快，研究团队意识到，活性位点只有在蛋白质被打开时才暴露出来。那么，是不是保持这个蛋白关闭就能让它沉默呢？于是他们设计了一个非常规的、多步骤的化学筛选来寻找候选物。而正是这样，导致了SHP2“分子胶”的发现。
[0010]通过晶体学和遗传突变实验，科学家们发现了一个化合物能够填补蛋白质靠近铰链处的一个孔，像胶水一样把所有东西“粘”起来。他们又将这种有类似药物特性的“分子胶”运用到包含酪氨酸激酶受体改变的人类肿瘤的模式小鼠身上，实验证明，癌细胞最终消失了。
[0011]催化位点抑制剂，其原理是SHP2作用底物酪氨酸磷酸酯，这一类抑制剂主要就含有模拟酪氨酸磷酸的离子官能团，来模拟作用底物作用于底物催化口袋，从而抑制酶的活性。虽然研究了十几年，但是还是没有达到很好体内治疗效果。因此催生出来变构位点抑制剂。首先诺华团队通过特殊的药物筛选方式获得首款变构位点抑制SHP099。它做为先导化合物，后来再此基础上通过计算机辅助药物设计发现更多的变构抑制剂。
[0012]SHP099具有一个变构作用机制，它通过该机制在一个自抑制的构形中使SHP2稳定。SHP099还能抑制RAS
‑
ERK信号作用，从而在人类癌细胞系中和小鼠肿瘤异种移植模型中抑制由RTK驱动的癌细胞扩增。
[0013]作为一个拥有全新作用机理的化合物，开发一个简单快速的检测方法，对于新药研发，及其体内外研究，包括吸收，分布，代谢，排泄等具有重要作用。因此建立此方法对于加快新药研发速度具有积极意义。

技术实现思路

[0014]本专利技术的目的是提供一种测定血浆(K2EDTA抗凝)中SHP099浓度的方法，解决上述现有技术问题中的一个或者多个。
[0015]本专利技术提供的一种测定血浆(K2EDTA抗凝)中SHP099浓度的方法，包括如下步骤：采用蛋白沉淀的方法对血浆样品进行预处理，获得测试样品；将测试样品采用高效液相色谱
‑
串联质谱进行定性定量分析；
[0016]所述高效液相色谱
‑
串联质谱的液相色谱条件包括：
[0017]色谱柱：GL Sciences，InertSustain，C18 HP，3μm，2.1
×
50mm(UP)；
[0018]色谱柱温：40℃；
[0019]流动相A：体积比为100/0.01的H2O/1M CH3COONH4溶液；
[0020]流动相B：体积比为100/1/0.01的MeOH/ACN/1M CH3COONH4溶液；
[0021]洗液：体积比为85/15的MeOH/ACN溶液；
[0022]自动进样器温度为4℃；
[0023]梯度洗脱，流速为0.5mL/min，进样量为2μL，分析时间为3.601min。
[0024]其中：待测物选用血浆(K2EDTA抗凝)。血浆是临床试验最常用的临床样品，易获得，且能准确地反映药物在体内的情况。
[0025]在某些实施方案中，所述梯度洗脱的程序为：
[0026]总时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0.1052480.7033671.4033371.411992.201992.2152483.605248
[0027]其中：考虑流速、流动相和进样量以及梯度洗脱的条件，不仅可以保证药物的出峰效果和响应值，也可使药物完全洗脱干净，避免对色谱柱的污染，同时也有利于回收率的提
升和后续质谱检测的灵敏度的提升。
[0028]本专利技术采用梯度洗脱的方式对血浆中的SHP099进行检测，流动相的洗脱比例在不同时间进行变化，综合考虑血浆基质效应等问题，使得药物出峰峰型对称，不仅将药物充分洗脱下来，且回收率高，干扰性小。
[0029]在某些实施方案中，所述高效液相色谱
‑
串联质谱的质谱条件包括：
[0030]离子源采用电喷雾离子源，喷雾电压为5500V，雾化温度为500℃，喷雾气压力为50Psi，辅助加热气压力为50Psi，气帘气压力为30Psi，碰撞气压力为9Psi，去簇电压为50eV；
[0031]碰撞室入口电压为12eV；
[0032]碰撞电压为35eV；
[0033]碰撞室出口电压为12eV；
[0034]正离子方式检测；
[0035]扫描方式为多重反应检测；
[0036]SHP099用于定量分析的离子对为：m/z353.1
→
m/z268.1；定性分析的离子对为：m/z353.1
→
m/z336.0。
[0037]其中：本专利技术方法的响应值合理，质谱参数合适，可持续检测。
[0038]在某些实施方案中，所述血浆样品预处理步骤如下：
[0039]S1、取出待测样品，平衡至室温；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定血浆(K2EDTA抗凝)中SHP099浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用蛋白沉淀的方法对血浆样品进行预处理，获得测试样品；将测试样品采用高效液相色谱
‑
串联质谱进行定性定量分析；所述高效液相色谱
‑
串联质谱的液相色谱条件包括：色谱柱：GL Sciences，InertSustain，C18 HP，3μm，2.1
×
50mm(UP)；色谱柱温：40℃；流动相A：体积比为100/0.01的H2O/1M CH3COONH4溶液；流动相B：体积比为100/1/0.01的MeOH/ACN/1M CH3COONH4溶液；洗液：体积比为85/15的MeOH/ACN溶液；自动进样器温度为4℃；梯度洗脱，流速为0.5mL/min，进样量为2μL，分析时间为3.601min。2.根据权利要求1所述的一种测定血浆(K2EDTA抗凝)中SHP099浓度的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：总时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0.1052480.7033671.4033371.411992.201992.2152483.6052483.根据权利要求1所述的一种测定血浆(K2EDTA抗凝)中SHP099浓度的方法，其特征在于，所述高效液相色谱
‑
串联质谱的质谱条件包括：离子源采用电喷雾离子源，喷雾电压为5500V，雾化温度为500℃，喷雾气压力为50Psi，辅助加热气压力为50Psi，气帘气压力为30Psi，碰撞气压力为9Psi，去簇电压为50eV；碰撞室入口电压为12eV；碰撞电压为35eV；碰撞室出口电压为12eV；正离子方式检测；扫描方式为多重反应检测；SHP099用于定量分析的离子对为：m/z353.1
→
m/z268.1；定性分析的离子对为：m/z353.1
→
m/z336.0。4.根据权利要求1所述的一种测定血浆(K2EDTA抗凝)中SHP099浓度的方法，其特征在于，所述血浆样品预处理步骤如下：S1、取出待测样品，平衡至室温；S2、将待测样品置于96深孔板中，加入MeOH涡旋混合后离心；S3、...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄启宽，祝永琴，胡海俊，金莹莹，
申请(专利权)人：上海精翰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：