用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，属于检测试剂盒技术领域，用荧光PCR建立能够区分ASFV和PCV2的精确鉴别检测方法就非常有应用价值，可为ASFV的防控和净化提供新的技术保障，通过参考GenBank中非洲猪瘟病毒的P72基因(MH713612.1)和猪圆环病毒2型的ORF1基因(AF027217)的高度保守序列设计得到针对非洲猪瘟病毒P72基因的引物对(ASFV

【技术实现步骤摘要】
用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种检测试剂盒，特别是涉及用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，属于检测试剂盒


技术介绍

[0002]非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，我国将其列为一类动物疫病。
[0003]ASF是养猪业的头号杀手，根据其在全球范围内的流行特点和我国养殖现状，如何对ASF进行科学防控是当前养猪业的重点和难点。
[0004]由于ASF的发病临床症状和病理变化与其他猪传染病很相似，在生产实践中与其它病原混合感染已成常见现象，混合感染场的猪群又经常会出现临床症状复杂，病变不典型，现场难以确诊，需要依据实验室诊断才能定性。
[0005]聚合酶链式反应技术已广泛应用于ASFV的诊断检测，OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》推荐的ASFV检测方法主要是传统PCR 和实时荧光PCR。
[0006]然而传统PCR需要进行凝胶电泳分析，操作繁琐，且灵敏度相对较低；实时荧光PCR的灵敏度和试验速度较传统PCR大大提升，并且可以同时特异性检测多种病原。
[0007]现有的商品化猪疫病荧光PCR试剂盒多为单通道PCR，1个试剂盒1次试验仅能检测1种病原，对于混合感染2种及以上的病原的同份猪病病料要确诊其病原就进行2种及以上试剂盒或进行2次及以上的PCR试验，费时费力，成本较高，为此设计一种用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒来解决上述问题。

技术实现思路

[0008]本专利技术的主要目的是为了提供用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，用荧光PCR建立能够区分ASFV和PCV2的精确鉴别检测方法就非常有应用价值，可为ASFV的防控和净化提供新的技术保障，通过参考GenBank中非洲猪瘟病毒的P72基因 (MH713612.1)和猪圆环病毒2型的ORF1基因(AF027217)的高度保守序列设计得到针对非洲猪瘟病毒P72基因的引物对(ASFV
‑
F/R) 及探针(ASFV
‑
P)和针对猪圆环病毒2型ORF1基因的引物对 (PCV2
‑
F/R)及探针(PCV2
‑
P)。
[0009]本专利技术的目的可以通过采用如下技术方案达到：
[0010]用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，包括引物探针混合物和Pro Taq HS Premix；
[0011]其中引物探针混合物包括工作浓度为200nM的ASFV
‑
F与 ASFV
‑
R；
[0012]工作浓度为150nM的ASFV
‑
Probe；
[0013]工作浓度为200nM的CSFV
‑
F与CSFV
‑
R，工作浓度为150nM的 CSFV
‑
Probe。
[0014]优选的，所述ASFV
‑
F为上游引物且基因序列为 CTGCATAATGGCGTTAAC；
[0015]其中ASFV
‑
F的识别标记为SEQ ID NO.1；
[0016]ASFV
‑
R为下游引物且基因序列为GCTGATACGTGTCCATAA；
[0017]其中ASFV
‑
R的识别标记为SEQ ID NO.2。
[0018]优选的，PCV2
‑
F为上游引物且基因序列为 CTCTCTATCGGAGGATTAC；
[0019]其中PCV2
‑
F的识别标记为SEQ ID NO.4；
[0020]PCV2
‑
R为下游引物且基因序列为CCACTTAAACCCTAAATGAA；
[0021]其中PCV2
‑
R的识别标记为SEQ ID NO.6。
[0022]优选的，ASFV
‑
F/R扩增得到的目的基因的序列CTGCATAATGGCGTTAACAACATGTCCGAACTTGTGCCAATCTCGGTGTTGATGAGGA TTTTGATCGGAGATGTTCCAGGTAGGTTTTAATCCTATAAACATATATTCAATGGGCC ATTTAAGAGCAGACATTAGTTTTTCATCGTGGTGGTTATTGTTGGTGTGGGTCACCTG CGTTTTATGGACACGTATCAGC；
[0023]其中ASFV
‑
F/R的识别标记为SEQ ID NO.7。
[0024]优选的，PCV2
‑
F/R扩增得到的目的基因的序列 CTCTCTATCGGAGGATTACTTCCTTGGTATTTTGGAAGAATGCTACAGAACAATCCAC GGAGGAAGGGGGCCAGTTCGTCACCCTTTCCCCCCCATGCCCTGAATTTCCATATGAA ATAAATTACTGAGTCTTTTTTATCACTTCGTAATGGTTTTTATTTTTCATTTAGGGTT TAAGTGG；
[0025]其中PCV2
‑
F/R的识别标记为SEQ ID NO.8。
[0026]优选的，ASFV
‑
probe的基因序列为 CACCAACAATAACCACCACGATGAA；
[0027]其中ASFV
‑
probe的识别标记为SEQ ID NO.3。
[0028]优选的，PCV2
‑
probe的基因序列为 AAGAATGCTACAGAACAATCCACGG；
[0029]其中PCV2
‑
probe的识别标记为SEQ ID NO.6。
[0030]优选的，其中ASFV
‑
probe的5'端连接有6
‑
FAM，3'端连接有BHQ1；
[0031]PCV2
‑
probe的5'端连接有VIC，3'端连接有BHQ1。
[0032]优选的，还不包括试剂盒的识别方法：
[0033]选取样品核酸/阳性标准品/阴性标准品2μL、引物探针混合物 1.5μL、Pro Taq HS Premix10μL和DEPC水补足至20μL；
[0034]反应程序为：95℃30s；95℃5s，57℃30s，40个循环，在每一循环退火结束时收集荧光信号；
[0035]通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值。
[0036]本专利技术的有益技术效果：
[0037]本专利技术提供的用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，用荧光PCR建立能够区分ASFV和PCV2的精确鉴别检测方法就非常有应用价值，可为ASFV的防控和净化提供新的技术保障，通过参考GenBank中非洲猪瘟病毒的P72基因(MH713612.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于：包括引物探针混合物和Pro Taq HS Premix；其中引物探针混合物包括工作浓度为200nM的ASFV
‑
F与ASFV
‑
R；工作浓度为150nM的ASFV
‑
Probe；工作浓度为200nM的CSFV
‑
F与CSFV
‑
R，工作浓度为150nM的CSFV
‑
Probe。2.根据权利要求1所述的用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于：所述ASFV
‑
F为上游引物且基因序列为CTGCATAATGGCGTTAAC；其中ASFV
‑
F的识别标记为SEQ ID NO.1；ASFV
‑
R为下游引物且基因序列为GCTGATACGTGTCCATAA；其中ASFV
‑
R的识别标记为SEQ ID NO.2。3.根据权利要求2所述的用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于：PCV2
‑
F为上游引物且基因序列为CTCTCTATCGGAGGATTAC；其中PCV2
‑
F的识别标记为SEQ ID NO.4；PCV2
‑
R为下游引物且基因序列为CCACTTAAACCCTAAATGAA；其中PCV2
‑
R的识别标记为SEQ ID NO.6。4.根据权利要求3所述的用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于：ASFV
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F/R扩增得到的目的基因的序列CTGCATAATGGCGTTAACAACATGTCCGAACTTGTGCCAATCTCGGTGTTGATGAGGATTTTGATCGGAGATGTTCCAGGTAGGTTTTAATCCTATAAACATATATTCAATGGGCCATTTAAGAGCAGACATTAGTTTTTCATCGTGGTGGTTATTGTTGGTGTGGGTCACCTGCGTTTTATGGACACGTATCAGC；其中ASFV

【专利技术属性】
技术研发人员：周秀蓉，翟颀，罗胜军，孙铭飞，贾春玲，吕殿红，温肖会，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：