一种检测重组杆状病毒基因组滴度的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测重组杆状病毒基因组滴度的方法，包括使用新型prepGEM酶裂解重组杆状病毒，5

【技术实现步骤摘要】
一种检测重组杆状病毒基因组滴度的方法


[0001]本专利技术涉及一种检测方法，具体涉及一种基因组滴度的检测方法。

技术介绍

[0002]根据市场调研机构Fortune Business Insights发布的报告，2019年基因治疗市场规模为36.1亿美元，预计到2027年将达到356.7亿美元，预测期内的年均复合增长率为33.6％。目前，基因药物的病毒类载体主要是腺相关病毒(Adeno
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Associated Virus,简称AAV)和腺病毒(Adenovirus)两大类。
[0003]2012年11月2日，以1型AAV为载体表达脂蛋白脂酶的药物Glybera被欧盟正式批准上市，递送表达编码脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，缩略为LPL)的转基因，用于治疗LPL缺失患者，但后来于2017年退市。2017年12月20日，美国Spark Therapeutics公司开发的Luxturna获FDA(Food and Drug Administration，缩略为FDA)批准，用于治疗Leber先天性黑蒙2型(Leber
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s Congenital Amaurosis 2,缩略为LCA2)，由于RPE65(Retinal Pigment Epithelium
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specific 65kDa Protein，缩略为RPE65)基因突变而导致失明的患者。它使用AAV2平台来递送正常RPE65基因，采用在视网膜下腔直接注射的方法将病毒导入眼球中。这是美国第一个利用AAV病毒作为载体，体内直接用药，用于治疗“基因缺失遗传病”的基因治疗药物。2019年5月24日，美国FDA批准Novartis公司AveXis Inc.开发的基因治疗产品Zolgensma，应用AAV9介导表达运动神经元存活蛋白SMN1(Survival Motor Neuron Gene 1，缩略为SMN1)，用于治疗SMN
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1缺失的脊髓性肌萎缩症的婴儿患者。
[0004]这些基因治疗的成功，激发了重组腺相关病毒(recombinant Adeno
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Associated Virus,缩略为rAAV)基因药物的研发热潮。
[0005]目前，大多数药企和CDMO平台采用传统的293细胞质粒转染的方式生产rAAV，无法实现规模化生产以有效降低rAAV的生产成本。利用重组杆状病毒(recombinant baculovirus)昆虫细胞系统生产rAAV是解决临床级病毒大规模生产的重要手段。
[0006]杆状病毒(Baculovirus)是一类双链、环状闭合、基因组大小范围为80
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180kb的DNA病毒。杆状病毒的形态一般为棍棒状，长度为200
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400nm，宽度为40
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110nm。杆状病毒共属一个科(Baculoviridae)，共4个属：甲型(Alphabaculovirus)、乙型(Betabaculovirus)、丙型(Gammabaculovirus)和丁型杆状病毒属(Deltabaculovirus)，它们分别以核型多角体病毒(Nuclear polyhedrosis virus，缩略为NPV)或颗粒体病毒(Granulovirus，缩略为GV)形式感染相应宿主。重组杆状病毒的受体细胞为昆虫细胞。应用较广的细胞系主要有2种：草地夜蛾细胞系(Spodoptera frugiperda cell line，Sf)，常用Sf21及其分离株Sf9细胞。昆虫杆状病毒表达载体系统是以杆状病毒作为外源基因载体，以昆虫细胞作为宿主进行基因组自我扩增与目的AAV病毒的扩增。
[0007]用杆状病毒携带Rep/Cap基因及ITR基因组，去感染悬浮培养的SF9昆虫细胞，可以包装出rAAV。该系统可通过穿梭载体灵活装载外源基因的片段，并在细菌内高效重组到杆状病毒基因组上，再将抽提出的重组杆状病毒基因组DNA经转染Sf9昆虫细胞，产生有感染
活性的重组杆状病毒。然后，利用重组杆状病毒感染悬浮培养的Sf9细胞生产rAAV。该方法的应用目前较为广泛，上市药物Glybera就是用的这种方法。
[0008]目前，重组杆状病毒的滴度检测方法主要有半数组织培养感染剂量法(TCID50)，在显微镜下观察表达EGFP荧光蛋白的细胞，或者检测GP64蛋白表达呈阳性的细胞；应用流式技术检测目标蛋白的表达；或者利用杆状病毒对于宿主细胞的生长造成干扰，用酸性磷酸酶测试宿主细胞数目。然而，这些方法检测时间周期长，通常至少需要60
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84小时，操作繁琐复杂，观察荧光蛋白的表达容易受假阳性干扰，用酸性磷酸酶检测细胞数目的方法本身标准偏差大。
[0009]在应用重组杆状病毒生产rAAV的工艺过程中，需要使用上一轮包装扩增的重组杆状病毒，感染下一轮生产的昆虫细胞，整个工艺过程需要轮与轮之间无缝衔接，一般需要扩增至少4
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6轮。在用上一轮生产扩增的重组杆状病毒感染下一轮生产的昆虫细胞时，需要在上一轮生产末快速、准确地检测重组杆状病毒的基因组滴度，以确定下一轮生产用于感染昆虫细胞的重组杆状病毒的精确用量，控制重组杆状病毒感染接种细胞的最佳感染复数(multiplicity of infection,缩略为MOI)。
[0010]上述检测方法，包括TCID50，流式检测和酶联免疫法(Enzyme
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linked immunosorbent assay,简称ELISA)等,由于检测时间太长(60
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84小时)，不能满足工艺需求。
[0011]所以，开发一种操作简便，检测时间短，能及时准确反馈重组杆状病毒基因组滴度的检测方法迫在眉睫。

技术实现思路

[0012]本专利技术的目的在于，解决上述现有技术的不足，通过应用微滴数字聚合酶链反应(droplet digital polymerase chain reaction,简称ddPCR)技术，快速、准确地检测重组杆状病毒(recombinant baculovirus)基因组滴度。本专利技术开发了一种用ddPCR绝对定量的方法，准确检测重组杆状病毒基因组滴度。本专利技术操作简便，从处理病毒到获得病毒基因组滴度数据，只需要6小时，尤其适用于用重组杆状病毒生产重组腺相关病毒(recombinant Adeno
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Associated Virus,简称rAAV)工艺中，轮与轮生产之间级级放大的无缝衔接。应用本专利技术技术，可以在前一轮工艺生产末快速、准确地检测重组杆状病毒的基因组滴度，从而确定下一轮生产用于感染Sf9昆虫细胞的杆状病毒的精确用量，实现用重组杆状病毒生产rAAV轮与轮传代的级级扩增。
[0013]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种检测重组杆状病毒基因组滴度的方法，包括使用新型prepGEM酶裂解重组杆状病毒，5
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15分钟裂解病毒，2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测重组杆状病毒基因组滴度的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1).取5μL 10X DNase I酶缓冲液，1
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5μL 1％Pluronic F
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68,1
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5μLDNase I酶,轻轻混合均匀，加入2
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10μL重组杆状病毒，加入无核酸酶水至总体积为50μL，轻轻吹打，混合均匀；将重组杆状病毒放置在37℃水浴中消化，以降解重组杆状病毒中的残留质粒，并在75℃孵育以灭活DNase I酶；消化灭活后，在重组杆状病毒中加入10μL 10X prepGEM酶缓冲液，1
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10μLprepGEM酶，加入无核酸酶水至总体积为100μL，轻轻吹打，混合均匀；将混合物置于75℃孵育，使prepGEM酶裂解重组杆状病毒；然后将混合物置于95℃孵育，使酶失活；(2).取12.5μL 2X ddPCR Supermix For Probes,加入0.1
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0.3μL浓度为100μM的EGFP引物和探针,1
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5μL重组杆状病毒处理液，加入无核酸酶水至总体积为25μL，轻轻吹打，混合均匀；如果重组杆状病毒滴度太高，稀释重组杆状病毒后再加入ddPCR混...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷静，周园，蒋鑫，王沁瑜，程志茹，徐刚明，郑艳军，陈琪，
申请(专利权)人：上海药明生基医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：