一种16型、18型HPV病毒核酸荧光定量PCR检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种16型、18型HPV病毒核酸荧光定量PCR检测方法及其试剂盒，该检测方法如下：核酸的提取；荧光定量RT

【技术实现步骤摘要】
一种16型、18型HPV病毒核酸荧光定量PCR检测方法及其试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种16型、18型HPV病毒核酸荧光定量PCR检测方法及其试剂盒。

技术介绍

[0002]人乳头瘤病毒(human papiLLomavirus，HPV)是一种无包膜包裹的双链闭环小DNA病毒，属于多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，具有普遍传染性，易引发妇女宫颈癌。目前，每年约有20万妇女死于该种疾病，且年轻化趋势越专利技术显，从而引发社会各界普遍关注。依据WHO国际癌症研究机构以及其他研究机构研究成果，将与宫颈癌发生有关的HPV亚型分为三种类型，分别为高风险型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82)、假定的高风险型(HPV26、53、66)以及低风险型(HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81)。其中常见的致癌病毒是HPV16、18。
[0003]目前HPV的检测方法主要包括HPV细胞学检测、HPV蛋白检测、HPV DNA检测以及HPV感染的血清学检测。以基因扩增为基础的HPV DNA检测是目前最灵敏的检测方法，可以检测出低水平的病毒感染，并且能够比较准确地对HPV感染状态进行分类，也可检测潜在期感染。对于HPV DNA检测，有两种不同的PCR方法，即型特异或通用引物PCR。型特异PCR就是应用仅扩增某个HPV基因型的引物，因此为了检测一个临床样本是否存在HPV DNA，必须单独进行多个型特异的PCR反应。目前国内已经获得批准上市的HPV PCR检测试剂产品总的来讲，劳动强度大、一次可检测的标准数量较少，费用昂贵。
[0004]综上亟需能够实现快速、有效且准确检测16型、18型HPV病毒型别的产品。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种成本低，快速简便，灵敏度高，假阴性率低的16型、18型HPV检测方法及其试剂盒。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种16型、18型HPV病毒核酸荧光定量PCR检测方法，所述检测方法的步骤如下：
[0008]提取待测样品总DNA：取1mL样本至1.5mL离心管中，12000
‑
13000rpm离心2
‑
10分钟，弃上清；沉淀中加入500μL灭菌生理盐水混匀，12000
‑
13000rpm离心2
‑
10分钟；再用灭菌生理盐水重复洗涤一次；去尽上清，沉淀中加入50μL HPV裂解液充分混匀，95
‑
100℃作用8
‑
10分钟，12000
‑
13000rpm离心2
‑
10分钟，上清即为纯化的病毒核酸，作为待检模板；
[0009]所述裂解液包括Tris.HCL、Triton
‑
X
‑
100、cheLex
‑
100；
[0010]步骤2：制备2份反应液，每份反应液包括预混合液、一对引物及相应的探针；
[0011]所述引物包括正向引物和逆向引物，所述16型HPV正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述18型HPV正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；与所述各正向引物
相对应的所述逆向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4所示；与所述各正向引物相对应的所述探针的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6所示；
[0012]步骤3：将两种对应的模板进行浓度稀释，制成标准曲线样品；，与所述各正向引物相对应的2种模板的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO:7～8所示；
[0013]步骤4：试剂的阴性对照、待测样品的阴性对照以及加入了标准品的待测样品上样；
[0014]步骤5：QPCR反应；
[0015]步骤6：将2种模板分别梯度稀释制成标准曲线样品，分析待测样品的检测结果。
[0016]优选地，标准样品的浓度梯度为每5μL含有1
×
105，1
×
104，1
×
103，1
×
102及10个靶序列拷贝。
[0017]优选地，采用ABI 7500荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM和VIC(HEX)荧光素，荧光信号收集设在60℃。
[0018]本专利技术提供一种16型、18型HPV病毒核酸荧光定量PCR检检测试剂盒，包括两组对应的引物及相应的探针以及反应液，还包括阳性质控品和阴性质控品；
[0019]所述阴性质控品为灭菌生理盐水；
[0020]所述阳性质控品和弱阳性质控品是以提纯的16型、18型HPV病毒基因组为模板，由2种型别相应的基因扩增引物进行PCR扩增，2种扩增产物连接，经基因测序确认正确后包装所得的假病毒；
[0021]探针序列的5
’
端标记有荧光报告基团，3
’
端标记有荧光淬灭基团，各型别检测引物及探针序列如下：
[0022]HPV16型：
[0023]上游引物HPV16
‑
F：核苷酸序列如SEQ ID NO:1：CAC AGT TAT GCA CAG AGC TGC；
[0024]下游引物HPV16
‑
R：核苷酸序列如SEQ ID NO:2：CAT ATA TTC ATG CAA TGT AGG TGT A；
[0025]Taqman荧光探针HPV16
‑
P：核苷酸序列如SEQ ID NO:5：
[0026]TGGCAGCACATAATGACATATTTGTACTGCGT；
[0027]HPV18型：
[0028]上游引物HPV18
‑
F：核苷酸序列如SEQ ID NO:10：CAC TTC ACT GCA AGA CAT AGA；
[0029]下游引物HPV18
‑
R：核苷酸序列如SEQ ID NO:11：GTT GTG AAA TCG TCG TTT TTC A；
[0030]Taqman荧光探针HPV18
‑
P：核苷酸序列如SEQ ID NO:6：AGGGATCCTTATTTTCAGCCGGTGCAG。
[0031]优选地，所述荧光报告基团选自6
‑
羧基荧光素、六氯
‑6‑
甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯
‑6‑
羧基荧光素、羧基
‑
X
‑
罗丹明、6
‑
羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6
‑
羧基
‑4’
,5
’‑
二氯
‑2’
,7
’本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种16型、18型HPV病毒核酸荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法的步骤如下：步骤1：提取待测样品总DNA：取1mL样本至1.5mL离心管中，12000
‑
13000rpm离心2
‑
10分钟，弃上清；沉淀中加入500μL灭菌生理盐水混匀，12000
‑
13000rpm离心2
‑
10分钟；再用灭菌生理盐水重复洗涤一次；去尽上清，沉淀中加入50μL HPV裂解液充分混匀，95
‑
100℃作用8
‑
10分钟，12000
‑
13000rpm离心2
‑
10分钟，上清即为纯化的病毒核酸，作为待检模板；所述裂解液包括Tris.HCL、Triton
‑
X
‑
100、cheLex
‑
100；步骤2：制备2份反应液，每份反应液包括预混合液、一对引物及相应的探针；所述引物包括正向引物和逆向引物，所述16型HPV正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述18型HPV正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；与所述各正向引物相对应的所述逆向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4所示；与所述各正向引物相对应的所述探针的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6所示；步骤3：将两种对应的模板进行浓度稀释，制成标准曲线样品，与所述各正向引物相对应的2种模板的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO:7～8所示；步骤4：试剂的阴性对照、待测样品的阴性对照以及加入了标准品的待测样品上样；步骤5：QPCR反应；步骤6：将2种模板分别梯度稀释制成标准曲线样品，分析待测样品的检测结果。2.根据权利要求1所述一种16型、18型HPV病毒核酸荧光定量PCR检测方法，其特征在于：标准样品的浓度梯度为每5μL含有1
×
105，1
×
104，1
×
103，1
×
102及10个靶序列拷贝。3.根据权利要求1所述一种16型、18型HPV病毒核酸荧光定量PCR检测方法，其特征在于：采用ABI 7500荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM和VIC(HEX)荧光素，荧光信号收集设在60℃。4.一种用于权利要求1至3任一项所述一种16型、18型HPV病毒核酸荧光定量PCR检测方法的PCR检测试剂盒，其特征在于：包括两组对应的引物及相应的探针以及反应液，还包括阳性质控品和阴性质控品；所述阴性质控品为灭菌生理盐水；所述阳性质控品和弱阳性质控品是以提纯的16型、18型HPV病毒基因组为模板，由2种型别相应的基因扩增引物进行PCR扩增，2种扩增产物连接，经基...

【专利技术属性】
技术研发人员：周明先，马楠，田明民，左志琴，
申请(专利权)人：昆山迪安医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：