本发明专利技术属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及耐热性提高的苯乙烯单加氧酶突变体及其用途。本发明专利技术将来源于Streptomyces exfoliatus sp.A1013Y的苯乙烯单加氧酶SeStyA进行分子改良，获得了一系列热稳定性显著提高的突变体，与野生型相比，突变体的催化活力高，反应速度更快，能缩短反应周期，获得更高的时空产率。催化性能提升的突变子将显著增强SeStyA的应用潜力。强SeStyA的应用潜力。强SeStyA的应用潜力。
【技术实现步骤摘要】
一种苯乙烯单加氧酶突变体及其应用
[0001]本专利技术属于基因工程和酶工程
，具体内容涉及耐热性提高的苯乙烯单加氧酶突变体及其用途。
技术介绍
[0002]环氧化合物的(R)
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和(S)
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对映体都是有机合成中活性药物、天然产物、精细化学品和高级聚合材料必不可少的重要中间体。因此，研究者花费了大量的精力致力于开发出有效的不对称环氧化方法。对于内部烯烃或带有官能团的烯烃，一般都是通过化学催化的环氧化来生成对映体纯的目标产物，但是化学法对末端烯烃的对映体选择性不足。生物催化介导的环氧化可以有效地从末端烯烃制备高度光学纯的环氧化产物。目前已报道了苯乙烯单加氧酶、细胞色素P450酶、氯过氧化物酶和烯烃单加氧酶均能以中等至优异的对映选择性催化末端烯烃的环氧化。其中苯乙烯单氧化酶(SMO)作为苯乙烯分解代谢途径中的第一个酶，可以说它是催化环氧化反应中最出色的生物催化剂，目前已经发现了大量的苯乙烯单加氧酶，可用于催化苯乙烯及其衍生物的环氧化并生成相应的(S)
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环氧化物且ee值大于99％。最近，我们又发现了多种具有(R)
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对映选择性的SMO，进一步拓宽了SMO的工具箱(Catalysis Science&Technology,2021,11(6):2195
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2201)。但是SMO的应用仍受到诸如低催化活性，低立体选择性以及稳定性不足等因素的限制。在探索酶的工业化应用进程中，稳定性往往是最关键的特性之一，因此提高蛋白的稳定性是很有必要的。
[0003]蛋白质稳定化(Protein stabilization)是一个常见的蛋白质工程目标。稳定性高的蛋白质通常具有以下几点优势：1)能够在高温、有机助溶剂或高浓度底物或产物等压力环境中更好的行使催化功能；2)蛋白质在常温下的使用寿命延长，其储存稳定性增加；3)在细菌中过度表达时能够避免形成包涵体，更容易生产制造；4)更适合作为酶定向进化的母本，是蛋白质工程更好的起点。目前主要是通过蛋白质工程来提高蛋白质的稳定性，而蛋白质工程的策略多种多样，包括了定向进化，基于蛋白质结构的理性设计以及基于序列信息的半理性设计。
技术实现思路
[0004]本专利技术采用序列一致性方法对来源于Streptomyces exfoliatus sp.A1013Y的苯乙烯单加氧酶SeStyA进行分子改良，以SEQ ID NO.2所示的序列为出发序列，将多个氨基酸进行替换后获得了热稳定性提高的突变体。苯乙烯单加氧酶SeStyA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
[0005]根据本领域公共知识，编码相同氨基酸的核苷酸密码子替换，构建的相关突变体的载体、基因工程菌等也属于本专利技术的保护范围。
[0006]为了达到以上目的，本专利技术利用在线软件Consensus Finder(http://kazlab.umn.edu/)获得了SeStyA潜在的稳定替换位点，从中选取一致性大于70％的12个氨基酸，构建获得了12个单突变子E274D，I18V，R376A，P58V，V162R，A312G，F180L，A52G，
A101G，Y254H，D338E，D96P和1个双突变子SeM2。测定其残余活力后发现，突变子A52G、D96P、A101G、V162R以及SeM2的热稳定性有所提高，以定点突变技术将SeM2拆分后获得了单点突变子W86C和D338E。将这6个突变子以不同的方式进行整合后得到SeM4、SeM5
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1、SeM5
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2、SeM6，通过活性测定最终获得了热稳定性最高的组合突变子SeM6。
[0007](1)首轮筛选获得的热稳定性提高的突变子的特征如下：
[0008]A52G：第52位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)。
[0009]D96P：第96位的天门冬氨酸突变为脯氨酸(DNA序列由GAC变为CCG)。
[0010]A101G：第101位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)。
[0011]V162R：第162位的缬氨酸突变为精氨酸(DNA序列由GTG变为CGT)。
[0012]SeM2：第86位的色氨酸突变为半胱氨酸(DNA序列由TGG变为TGC),第338位的天门冬氨酸氨酸突变为谷氨酸(DNA序列由GAC变为GAA)。
[0013](2)将双位点突变子SeM2拆分为单点突变子的特征如下：
[0014]W86C：第86位的色氨酸突变为半胱氨酸(DNA序列由TGG变为TGC)。
[0015]D338E：第338位的天门冬氨酸突变为谷氨酸(DNA序列由GAC变为GAA)。
[0016](3)六个位点的整合突变子的特征如下：
[0017]SeM4：第52位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)，第96位的天门冬氨酸突变为脯氨酸(DNA序列由GAC变为CCG)，第101位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)，第162位的缬氨酸突变为精氨酸(DNA序列由GTG变为CGT)。
[0018]SeM5
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1：第52位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)，第86位的色氨酸突变为半胱氨酸(DNA序列由TGG变为TGC)，第96位的天门冬氨酸突变为脯氨酸(DNA序列由GAC变为CCG)，第101位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)，第162位的缬氨酸突变为精氨酸(DNA序列由GTG变为CGT)。
[0019]SeM5
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2：第52位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)，第96位的天门冬氨酸突变为脯氨酸(DNA序列由GAC变为CCG)，第101位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)，第162位的缬氨酸突变为精氨酸(DNA序列由GTG变为CGT)，第338位的天门冬氨酸突变为谷氨酸(DNA序列由GAC变为GAA)。
[0020]SeM6：第52位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)，第86位的色氨酸突变为半胱氨酸(DNA序列由TGG变为TGC)，第96位的天门冬氨酸突变为脯氨酸(DNA序列由GAC变为CCG)，第101位的丙氨酸突变为甘氨酸(DNA序列由GCG变为GGC)，第162位的缬氨酸突变为精氨酸(DNA序列由GTG变为CGT)，第338位的天门冬氨酸突变为谷氨酸(DNA序列由GAC变为GAA)。
[0021]这些组合突变子SeM4、SeM5
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1、SeM5
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2和SeM6的热稳定性较野生型均有所提高，其中SeM6提升幅度最大，为野生型的4.45倍，而相对活力也有所提高，为野生型的1.5倍。SeM6在50℃时的热失活半衰期是野生型的5倍，相对活力约为野生型的1.5倍，最适反应温度由45℃提高到50℃，而且产物光学纯度与野生型相当。SeM6的可溶性本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种苯乙烯单加氧酶突变体，其特征在于：以SEQ ID NO.2所示的序列为出发序列，第52位的丙氨酸突变为甘氨酸，第96位的天门冬氨酸突变为脯氨酸，第101位的丙氨酸突变为甘氨酸，第162位的缬氨酸突变为精氨酸。2.一种苯乙烯单加氧酶突变体，其特征在于：将权利要求1所述的突变体的第86位的色氨酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴中柳，肖虎，刘艳，裴小琼，杨玉洁，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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