一种重组羧肽酶G2突变体及其基因、制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种重组羧肽酶G2突变体及其基因、制备方法和应用。所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术获得的重组羧肽酶G2突变体水解甲氨蝶呤的效果明显提升，降解效率十分可观，且筛选方法简单直观快速有效。效。效。

【技术实现步骤摘要】
一种重组羧肽酶G2突变体及其基因、制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物大分子
，尤其是涉及一种重组羧肽酶G2突变体及其基因、制备方法和应用。

技术介绍

[0002]羧肽酶G2(Carboxypeptidase G2，CPG2)是来自假单胞菌的一种42kDa的锌依赖性金属酶，能将叶酸及其类似物中的谷氨酸部分分解出来，能大量又快速地将甲氨蝶呤(MTX)水解并转化为非活性代谢产物，降低大剂量MTX在临床肿瘤化疗中导致的风险。MTX是叶酸拮抗类抗肿瘤药，正常情况下经肾排泄。但大剂量使用MTX后，其在肾脏中结晶并沉淀，导致患者肾功能严重受损乃至肾衰竭，最终使血液中积累大量MTX，进而引发肝肾损伤、严重口腔溃疡、肠内膜损伤、皮疹等。血液透析或腹膜透析都无法清除该药物。严重可引发MTX中毒反应，死亡率极高。目前临床上对MTX中毒的急救措施主要包括亚叶酸钙竞争性解毒、碱化尿液、水化等。但90％以上患者仍不能逆转MTX的肾毒性。由于羧肽酶G家族可水解叶酸及其类似物，且CPG2识别MTX能力最强，CPG2可直接将血浆中的MTX水解成谷氨酸和4
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脱氧
‑4‑
氨基
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N10
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甲基蝶酸，二者不通过肾脏消除，且无法透过血
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脑屏障(BBB)和细胞膜，因而不会抵消细胞内MTX的化疗作用。
[0003]CPG2还被用于抗体定向酶前药治疗(ADEPT)与基因导向性前药疗法(GDEPT)。ADEPT是利用抗体作为载体携带专一性活化酶，选择性地结合于肿瘤部位，使前药可以区域特异性地在肿瘤组织内转化为活性细胞毒分子，起到专一杀伤肿瘤的作用。而GDEPT是利用腺病毒作为载体将CPG2基因转染至肿瘤细胞，并在肿瘤细胞内表达CPG2酶，使前药可以特异性地在肿瘤组织内产生细胞毒性，形成肿瘤自杀效果。
[0004]目前国内对CPG2的研究较少，主要在于对其初步进行表达载体的构建、原核表达、分离纯化及分析。而相对于国外，由于CPG2较早被研究，其产品匹谷卡酶于2012年2月获FDA批准上市。现在主要研究都是将CPG2原始序列，在大肠杆菌中表达。但近年来，随着CPG2的临床应用，发现CPG2的催化效率较低，成人单次治疗给药剂量大，且彻底解毒需要多次给药，并且单价昂贵，无法大规模推广使用，许多患者仍在经受MTX中毒的折磨。同时，因为前药疗法的多次循环治疗，导致了患者严重的免疫应答。近年来，国外许多研究者开始关注CPG2酶的性能改造。而国内因为药物还未引进，该方面的研究甚少。
[0005]酶的定向进化，同物种进化相类似，包括两个要素——突变与选择。但突变既可以随机发生，也可以定点发生，在突变的基础上，施加一个人为偏好的方向进行筛选，因此称之为“定向”。酶定向进化主要使用酶工程等手段，反复的突变编码基因，并进行蛋白表达和筛选，诱使酶的结构及功能发生定向改变，从而在实验室完成在自然界需要成千上万年的进化，最终获得性能改进酶蛋白。
[0006]易错PCR，是1989年由David W.Leung团队最先提出，随后成为体外改造筛选的经典手段，因其操作简便、突变效率高等优点成为目前应用最为广泛的进化手段之一。但该方法无法控制正负突变效率，导致负突变频率较高，筛选难度较大，所以需要建立高效快速的
筛选方法，加以配合才能在庞大的文库进行有效筛选。
[0007]筛选培养基，是指根据某种微生物特殊的营养要求或对某些特殊化学、物理性质而设计的，从而可以选择性筛选这种微生物的培养基。
[0008]叶酸作为甲氨蝶呤类似物，羧肽酶G2可将其水解，并且该反应可在培养基平板上显现，所以使用叶酸培养基，并加入IPTG、卡那霉素诱导羧肽酶G2的反应，在平板可完成突变文库的初步筛选，大大减少了筛选难度。
[0009]菌株高通量筛选，使用深孔培养板单次大量培养筛选突变体，可高效配合随机突变带来的大量突变文库筛选。培养板在1951年设计生产后，主要应用于分析领域，但由于培养板可进行高通量实验，逐渐被用于细胞培养、高通量筛选、药物和酶等变体筛选等研究。近年也逐渐应用于菌株筛选与选育，但目前高通量筛选技术在蛋白质异源表达方面的应用研究得较少。高通量培养与高通量分析相结合才能使得定向进化的高通筛选得以实现，高效获得性能优化的突变体酶。
[0010]在大肠杆菌表达系统中，通过去除N端22个残基信号肽，首次实现了保持CPG2的可溶性和活性，同时实现高产(250mg/L)重组表达和易于后期纯化。所以本专利技术的研究，建立于无信号肽的羧肽酶G2基础上进行定向进化，继承其可溶性、活性及蛋白高产，以筛选活性进一步优化的突变羧肽酶G2。
[0011]由于羧肽酶G2用药量大，水解甲氨蝶呤活性低，本项目利用酶的定向进化原理，将羧肽酶G2基因进行随机突变，建立初筛和复筛的方法，筛选获得能高效水解甲氨蝶呤的重组羧肽酶G2大肠杆菌突变株，旨在获得比原始羧肽酶G2活性更高的突变体。目前需要解决的问题在于选取突变方法及建立高效的筛选方法，获得活性更高的重组羧肽酶G2。

技术实现思路

[0012]本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中存在的羧肽酶G2水解甲氨蝶呤活性低，进行体外改造的突变时无法控制正负突变效率，导致负突变频率较高、筛选效率低的缺陷，提供一种重组羧肽酶G2突变体及其基因、制备方法和应用。
[0013]本专利技术将羧肽酶G2基因进行随机突变，并建立初筛和复筛的方法，筛选获得能高效水解甲氨蝶呤的重组羧肽酶G2大肠杆菌突变株，旨在获得比原始羧肽酶G2活性更高的突变体。本专利技术同时将原序列以该方法进行载体构建，并将两株菌株进行同条件诱导表达，同条件酶活检测，实验证明本专利技术以该方式表达检测的原始序列酶与文献(Jeyaharan，et al.Soluble expression,purification and functional characterisation of carboxypeptidase G2 and its individual domains，Protein Expression&Purification,2016,127:44
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52)所指出的酶活相一致，筛选到的突变序列以上述方式表达的酶活高于原始序列酶。
[0014]尽管现有技术中已有专利文献报道了酶活较高的羧肽酶G2，然而均非通过对酶本身性质的改进，而是通过纯化方法或者对蛋白分子进行末端修饰后提高了整体酶活。例如CN101509012B通过优化纯化方法实现了羧肽酶G2的高表达。该专利中的羧肽酶G2尽管也具有较高比活，但其与本专利技术在载体构建方式上有所不同，且在高表达过程中，使用了肠激酶进行融合表达，并在亲和层析后去除了载体所携带的his标签，完成了Pet
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his
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肠激酶
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cpg2的载体，后期纯化过程中将肠激酶进行去除，得到的纯cpg2进行了酶活检测计算。其中
的肠激本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羧肽酶G2的突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，编码所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。3.一种编码如权利要求1所述突变体的分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸包含如SEQ ID NO:1所示的序列。4.一种包含如权利要求3所述分离的核酸的表达载体。5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的骨架为pET
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28a。6.一种包含如权利要求4或5所述的表达载体的转化体。7.一种制备如权利要求1或2所述的突变体的方法，其特征在于，所述方法包括培养如权利要求6所述的转化体，并从培养产物中提取所述突变体。8.一种筛选重组羧肽酶G2突变体的方法，所述方法包括：随机突变文库平板初步筛选，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢丽萍，胡又佳，沈鸿月，徐磊，韩姝，李文杰，张伟，
申请(专利权)人：中国医药工业研究总院，
类型：发明
国别省市：