一种表达量提高的截短型ATP7B基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种表达量提高的截短型ATP7B基因及其应用。通过去掉ATP7B全长基因中金属结合域1

【技术实现步骤摘要】
一种表达量提高的截短型ATP7B基因及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种表达量提高的截短型ATP7B基因及其应用。

技术介绍

[0002]肝豆状核变性也称威尔逊病(Wilson disease，WD)，是一种以铜代谢障碍为特征的常染色体隐性遗传疾病，临床表现主要是进行性肝硬化、肾脏损伤、角膜色素环等。研究证明WD是由于ATP7B基因突变导致，该基因编码铜转运P型ATP酶(copper
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transporting P
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type ATPase,ATP7B)。ATP7B是一种表达在多器官的膜蛋白，主要功能是促进铜随血液及胆汁排泄。当ATP7B基因发生突变时，通过影响蛋白的合成、折叠、定位及降解等过程使得ATP7B蛋白转运功能减弱或缺失，转运铜能力下降，引起血清铜蓝蛋白合成减少、胆管排铜受损。过量的铜蓄积在体内，引起细胞坏死和器官损害，后期严重影响患者的生活质量，最终可引起死亡。WD一经诊断，需要进行长期、综合性的临床治疗，并且要求早治疗、终身治疗、定期随访，中断治疗将很可能恶化为急性肝衰竭。
[0003]目前WD的治疗方案主要有饮食治疗和药物治疗以及肝移植等。饮食治疗要求患者避免高铜饮食(例如贝类，坚果，巧克力，蘑菇和动物内脏等)。药物治疗主要是建立负铜平衡，采用的药物主要包括金属螯合剂：D
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青霉胺和曲恩汀；抑制铜离子吸收药物：锌盐和四硫代钼酸铵(TM)。而饮食治疗由于限制了食物的选择，会影响了患者饮食生活习惯，从而可能导致患者的依从性降低，难以达到预期的治疗效果。
[0004]在WD发展到晚期肝炎和脑损伤之前进行早期的药物治疗，通常在2
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6个月之内，大于90％的患者肝功能和转氨酶会得到很好的改善，持续进行更长时间的治疗，有50％
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60％的患者会有神经系统的改善。然而每种药都有不同的疗效和副作用，具体使用方法需要依据患者病情而定，但药物治疗通常是终身的。此外，铜螯合剂药物促进尿铜排出时常常导致严重的副作用，如过敏反应和慢性关节损伤，无法进行长期治疗。另一种治疗方法是肝移植，因为WD主要是一种以肝细胞受损为特征的疾病，而肝脏是铜的主要代谢器官，因此肝脏移植可以被视为WD基因缺陷的表型校正，并可以恢复铜稳态。但肝移植有可能会导致神经系统病情的恶化，此外，肝移植还存在治疗费用高、难以找到合适的供体等困难。因此亟需找到一种治疗WD的新策略。
[0005]早期有一些研究利用重组腺病毒和慢病毒将ATP7B导入WD模型——Long
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Evans Cinnamon(LEC)大鼠体内来进行基因治疗，结果表明肝脏导入外源ATP7B的基因治疗方案是可行的，但此治疗方法却存在一定的不足。例如腺病毒不能整合到宿主细胞染色体中，只能瞬时表达，疗效不持久且经常会引起机体较强的免疫反应。作为基因载体，慢病毒具有容量大、不易诱发宿主免疫反应等优点，但由于慢病毒载体会诱发转基因整合到宿主基因组上，因此应用到人体的安全性有待进一步证实。这些结果都促使研究人员寻找更长久、有效、安全的WD基因治疗策略，基因治疗也是当前治疗WD的研究热点。
[0006]近年来，基于重组腺相关病毒导入人源的ATP7B在动物实验中取得了不错的效果。
通过有肝嗜性的AAV8载体将人源ATP7B基因导入肝细胞(AAV8
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ATP7B)，补偿突变的ATP7B，从而使得ATP7B基因能够正常行使其功能，该治疗方法可以有效的改善WD小鼠的尿铜和血清铜蓝蛋白，缓解肝脏病变。但AAV的包装量有限，全长的ATP7B基因较大，接近AAV的包装上限，造成包装困难和产量低下，因此，若能找到一种与全长ATP7B有相当排铜功能的截短型ATP7B，就有望克服这一限制。
[0007]综上所述，本专利技术旨在提供一种新的截短型ATP7B基因片段，以缓解上述问题中的至少一项。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种新型截短型ATP7B基因，具体技术方案如下。
[0009]一种表达量提高的截短型ATP7B基因，所述基因的核苷酸序列包括如Seq ID No.1所示的全长和/或其中的片段。
[0010]进一步，所述基因的氨基酸序列包括如Seq ID No.2所示的全长和/或其中的片段。
[0011]进一步，所述基因的核苷酸序列中包含一段kozak序列。
[0012]Kozak序列是位于真核生物mRNA 5
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端帽子结构后面的一段核酸序列，通常是GCCACCAUGG，可显著增强蛋白质翻译。其中，第4位G的作用较强(以AUG起始密码子的A为第1位碱基)；然而，这个规则限定了起始密码子紧邻的氨基酸编码种类只能是缬氨酸(GTT/GTC/GTA/GTG)、丙氨酸(GCT/GCC/GCA/GCG)、天冬氨酸(GAT/GAC)、谷氨酸(GAA/GAG)和甘氨酸(GGT/GGC/GGA/GGG)。虽然可以通过强行加入上述氨基酸的密码子来实现第4位碱基是G，但是这种策略有增加治疗基因的免疫源性、破坏基因功能的风险。本专利技术提供的新型截短型ATP7B基因，通过去掉一个不必要的氨基酸，从而在不额外引入多余氨基酸的条件下形成了较强的Kozak序列，可以提高ATP7B基因翻译效率。
[0013]进一步，所述kozak序列的核苷酸序列包括如Seq ID No.3所示的全长和/或其中的片段。
[0014]包含上述新型截短型ATP7B基因核苷酸的重组腺相关病毒载体rAAV。
[0015]腺病毒载体转基因效率高；可转导不同类型的人组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞的限制；容易制得高滴度病毒载体。
[0016]进一步，构建所述重组腺相关病毒载体的腺相关病毒选自2型、5型、8型和9型AAV或其变体中的一种或几种。
[0017]上述重组腺病毒载体在制备治疗威尔逊病的药物中的应用。
[0018]本专利技术的目的还在于提供所述新型截短型ATP7B基因的应用及其制备方法。
[0019]一种治疗威尔逊病的药物，所述药物含有上述的截短型ATP7B基因全长和/或其中的片段。
[0020]进一步，所述药物还含有药学上可接受的任何辅料和/或助剂。
[0021]一种表达量提高的截短型ATP7B基因的制备方法，包括以下步骤：
[0022]1)利用重叠PCR技术(overlap PCR)去掉ATP7B全长基因中金属结合域1
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4获得截短突变体基因片段tATP7B；重叠PCR扩增使用2个引物对。其中，第一引物对正向引物F1序列
如Seq ID No.6所示；反向引物R1序列如Seq ID No.7所示。第二引物对正向引物F2序列如Seq ID No.8所示；反向引物R1序列如Seq ID No.9所示。
[0023]然后以tATP7B基因为模板，设计引物进行PCR扩增，利用同源重组分子克隆技术，将扩增产物装入pVAX1载体，得到本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达量提高的截短型ATP7B基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列包括如Seq ID No.1所示的全长和/或其中的片段。2.如权利要求1所述的截短型ATP7B基因，其特征在于，所述基因的氨基酸序列包括如Seq ID No.2所示的全长和/或其中的片段。3.如权利要求1所述的截短型ATP7B基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列中包含一段kozak序列。4.如权利要求3所述的截短型ATP7B基因，其特征在于，所述kozak序列的核苷酸序列包括如Seq ID No.3所示的全长和/或其中的片段。5.包含权利要求1所述截短型ATP7B基因核苷酸的重组腺病毒载体rAAV。6.如权利要求5所述的重组腺病毒载体，其特征在于，所述腺病毒选自2型、5型、8型和9型AAV中的一种或几种。7.权利要求5或6所述的重组腺病毒载体在制备治疗威尔逊病的药物中的应用。8.一种治疗威尔逊病的药物，其特征在于，所述药物含有权利要求1
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4任一项所述的截短型ATP7B基因全长和/或其中的片段。9.如权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物还含有药学上可接受的任何辅料和/或助剂。10.一种表达量提高的...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚少华，董飚，
申请(专利权)人：四川至善唯新生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：