一种分子标记引物及马铃薯晚疫病检测方法技术

本发明专利技术公开一种分子标记引物及马铃薯晚疫病鉴定方法，分子标记引物用于鉴定马铃薯晚疫病致病疫霉，所述分子标记如序列表SEQ ID NO：1～6所示。鉴定方法包括如下步骤：提取待测材料组织DNA；使用所示分子标记引物进行PCR扩增；PCR扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。本发明专利技术提供的三对引物仅在致病疫霉DNA为模板时能获得阳性扩增条带，扩增产物经测序分析与预期序列的相似度分别为94.96％、97.71％、96.44％，而在以辣椒疫霉等近缘种的基因组DNA为模板时均无克隆条带，引物特异性好，能有效区分近缘种。本发明专利技术方法可以检测到没有任何病斑、但是已经染菌的叶片，这对病害防控相当重要。防控相当重要。防控相当重要。

【技术实现步骤摘要】
一种分子标记引物及马铃薯晚疫病检测方法


[0001]本专利技术属于马铃薯晚疫病基因检测领域，涉及检测马铃薯晚疫病的分子标记引物，以及使用该分子标记引物在马铃薯晚疫病检测方法中的应用。

技术介绍

[0002]马铃薯的全球种植面积和总产量仅次于水稻、小麦和玉米，是全球第四大作物。我国是全球最大的马铃薯生产国，将马铃薯列为水稻、小麦、玉米之后的第四大主粮。马铃薯生产实践中多采用块茎繁殖，但这种营养繁殖方式易造成病原菌代代相传并不断积累，其中尤以马铃薯晚疫病最为严重。马铃薯晚疫病是一种在全世界绝大多数马铃薯种植区流行的毁灭性病害，是马铃薯最具毁灭性的病害，在马铃薯整个生育期内，只要条件适宜，其病原菌——致病疫霉Phytophthora infestans即可快速产生大量游动孢子，并在短时间内完成数代循环侵染，导致30
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60％的产量损失，甚至绝收。时至今日，马铃薯晚疫病每年造成的经济损失依然超过60亿美元，如何有效防控该病害仍是全球面临的共同问题。
[0003]传统的晚疫病检测方法包括观察发病症状和分离病原物进行形态学鉴定两种。然而直接观察容易遗漏发病初期的植物材料，且致病疫霉引发的病害易与Pythiumspp.，Fusariumspp. 和Rhizoctoniaspp.引起的病害症状混淆。因此，分离得到致病疫霉菌是非常有必要的。但致病疫霉的分离纯培养有较高的技术要求，且可用于病菌鉴定的形态学特征很少，鉴定起来也比较困难。
[0004]分子检测的出现为植物病害的快速、准确诊断提供了新的思路和方法。近年来基于PCR 技术的植物病害分子检测技术在植物病害防治中起着越来越重要的作用。
[0005]在实现本专利技术过程中，专利技术人发现现有技术中至少存在如下技术问题中的一个问题：
[0006]基于转录间隔区(ITS)、线粒体基因Cox1
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Cox2等靶标的分子检测技术受限于序列差异小、GC含量高等原因，难以将靶标疫霉菌与其近缘种区分开或不适宜于用作分子靶标。
[0007]现有技术中公开了以致病疫霉Ypt1序列为分子靶标，设计了2对引物对11种不同疫霉菌进行检测，结果显示11种疫霉菌均有扩增条带，引物特异性较低。
[0008]现有技术还公开了以致病疫霉核糖体DNA转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS) ITS
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1为检测靶标开发了一套分子检测技术体系，但该检测靶标不能区分近缘种芋疫霉 (Phytophthora colocasiae)、恶疫霉(Phytophthora cactorum)和棕榈疫霉(Phytophthorapalmivora)。
[0009]线粒体基因Cox1
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Cox2通常GC含量较高，而Lpv基因又少有研究，只针对部分疫霉菌可以进行有效检测，不适用于致病疫霉菌的检测。
[0010]病害分子检测体系的建立，关键在于使用合适的分子靶标。
[0011]因此，发掘新的分子检测靶标，对于完善致病疫霉分子精准检测体系及提高我国马铃薯晚疫病病害管理水平具有重要意义。

技术实现思路

[0012]鉴于此，本专利技术目的在于提供一种能够精准检测马铃薯晚疫病的分子标记引物。
[0013]本专利技术的又一目的在于提供一种使用前述分子标记引物检测马铃薯晚疫病的方法。
[0014]专利技术人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本专利技术提供的技术方案是，提供一种用于检测马铃薯晚疫病的分子标记引物，所述分子标记为下列引物对中的一对或多对：
[0015]第一引物对：
[0016]第一上游引物PiF1：5'
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GCTACCAACATCTTCCACAATCT
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3'；
[0017]第一下游引物PiR1：5'
‑
TCTCTAAAACCTCTGAGCCCCT
‑
3'；
[0018]第二引物对：
[0019]第二上游引物PiF2：5'
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CTGAAAATGGACGGGGATAGCGA
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3'；
[0020]第二下游引物PiR2：5'
‑
TGCGATGTGAGCGATGGCAAATG
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3'；
[0021]第三引物对：
[0022]第三上游引物PiF3：5'
‑
ATGGACGGGGATAGCGACTCTTA
‑
3'；
[0023]第三下游引物PiR3：5'
‑
GATGCCCTTGCTGACTCACCTG
‑
3'。
[0024]本专利技术还提供了一种马铃薯晚疫病的检测方法，使用权利要求1所述分子标记引物，包括如下步骤：
[0025]a)提取待测材料组织DNA；
[0026]b)以步骤a)提取得到的DNA为模板，使用所示分子标记引物进行PCR扩增，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，59.3℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸8min；
[0027]c)PCR扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0028]根据本专利技术马铃薯晚疫病的检测方法的一个具体实施方式，所述PCR扩增的总体系为 20μL：无菌ddH2O7μL、10μM上游引物1μL、10μM下游引物1μL、2
×
Easy Taq PCR Super Mix 酶10μL、模板DNA 1μL。
[0029]与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：
[0030]a)本专利技术提供的三对引物仅在致病疫霉DNA为模板时能获得阳性扩增条带，扩增产物经测序分析与预期序列的相似度分别为94.96％、97.71％、96.44％，而在以辣椒疫霉等近缘种的基因组DNA为模板时均无克隆条带，引物特异性好，能有效区分近缘种。
[0031]b)本专利技术3对引物在59.3℃均能获得很好的扩增效果，检测灵敏度分别达到26.9、 2.42、25.5拷贝/μL。
[0032]c)本专利技术方法中，以优化的检测体系对3个县市共63个大田叶片样本进行检测，病叶检出率分别达到83.33％、87.04％、85.19％；显著高于詹芳芳等的引物Pi
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F (TTGTGAAGGCGTCATTCC)、Pi
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R(CCGAGAGGATGCTTACGA)的检测结果。
[0033]d)本专利技术方法可以检测到0级病叶，即没有任何病斑、但是已经染菌的叶片，这对病害防控相当重要。
附图说明
[0034]为了更清楚地说明本专利技术实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测马铃薯晚疫病的分子标记引物，其特征在于，所述分子标记为下列引物对中的一对或多对：第一引物对：第一上游引物PiF1：5'
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GCTACCAACATCTTCCACAATCT
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3'；第一下游引物PiR1：5'
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TCTCTAAAACCTCTGAGCCCCT
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3'；第二引物对：第二上游引物PiF2：5'
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CTGAAAATGGACGGGGATAGCGA
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3'；第二下游引物PiR2：5'
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TGCGATGTGAGCGATGGCAAATG
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3'；第三引物对：第三上游引物PiF3：5'
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ATGGACGGGGATAGCGACTCTTA
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【专利技术属性】
技术研发人员：陶向，唐雪，李洪浩，雍彬，黄维藻，
申请(专利权)人：四川儒愿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：