一种基于高通量测序鉴定小麦赤霉和茎基腐病菌种、毒素类型和多菌灵抗性的检测方法技术

本发明专利技术涉及农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，公开了一种基于高通量测序鉴定小麦赤霉和茎基腐病菌种、毒素类型和多菌灵抗性的检测方法。包括以下步骤：S1：扩增小麦赤霉病菌或茎基腐病菌目的基因片段；S2：混合扩增产物，在Illumina平台上进行高通量双端测序；S3：采用Python脚本一步自动化完成数据拆分、序列比对、比对文件转换排序、变异检测和基因分析。同时，脚本自动统计分型结果，根据特异性SNP位点鉴定引起赤霉病菌和茎基腐病菌的11个种镰孢菌、3种毒素化学型以及对4种杀菌剂多菌灵的抗药突变类型。开发的特异性barcode标签，可以在1个扩增子文库中特异性标记384个菌株。本方法适合大量病原菌的高通量检测，能够为区域性病害防控策略的制定提供重要依据。害防控策略的制定提供重要依据。

【技术实现步骤摘要】
一种基于高通量测序鉴定小麦赤霉和茎基腐病菌种、毒素类型和多菌灵抗性的检测方法


[0001]本专利技术涉及一种基于高通量测序鉴定小麦赤霉和茎基腐病菌种、毒素类型和多菌灵抗性的检测方法，属于农作物病害检测、鉴定及防治


技术介绍

[0002]由多种镰孢菌引起的赤霉病和茎基腐病是影响我国小麦生产的重要病害，在亚洲、欧洲、加拿大、美国北部和澳大利亚等地频繁爆发，造成严重的产量损失。除此之外，其病原物镰孢菌代谢产生单端孢霉烯族毒素污染食物和饲料还可造成人类和动物严重疾病和免疫力下降，阻止真核生物蛋白质合成。因此，造成食品安全上的重大隐患。
[0003]多达10几种镰孢菌可以引起小麦赤霉病和茎基腐病，其中引起赤霉病的主要有F.graminearum、F.asiaticum、F.meridionale、F.culmorum、F.pseudograminearum、F.poae、F.cerealis等，引起茎基腐病的主要有F.pseudograminearum、F.graminearum、F.asiaticum等，两种病害致病菌有一定程度重叠。目前，已经有多种赤霉病菌和茎基腐病菌的检测方法的报道。如Nicholson等(1998)开发了F.graminearum和F.culmorum的特异性PCR引物。Yin等(2009)根据cyp51A基因多样性开发了鉴定F.graminearum和F.asiaticum的普通PCR和荧光定量PCR方法。Niessen等(2010)开发了环介导等温扩增检测F.graminearum的方法。以上方法均为一次检测一种病原菌，无法实现多种病原菌高通量检测。
[0004]引起赤霉病和茎基腐病的镰孢菌可以产生多种真菌毒素，明确镰孢菌的毒素化学型对于评估小麦毒素污染风险具有重要意义。引起两种病害的镰孢菌主要产生B型单端孢霉烯族毒素毒素，主要包括雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol，简称NIV)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，简称DON)，其中DON毒素又具有两种衍生物，分别为3
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乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3
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Acetyldeoxynivalenol，简称3ADON)和15
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乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15
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Acetyldeoxynivalenol，简称15ADON)。基于毒素合成基因簇序列差异，国内外已报道多种基于PCR的毒素化学型检测方法，如Chandler等(2003)通过Tri7和Tri13基因检测了三种镰刀菌F.graminearu，F.culmorum和F.cereali产毒情况，应用了10对引物，检测程序仍较为复杂，李和平等(2005)利用Tri5
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Tri6基因间隔区序列设计一对引物，能够稳定的检测出禾谷镰刀菌的NIV和DON两种毒素化学型。以上方法主要仍局限于少数种镰孢菌的检测。
[0005]于长期缺乏有效的抗病品种，对于小麦赤霉病主要采取化学防治。多菌灵(苯并咪唑类)是应用最多的一种化学药剂。自从1970年沈阳化工研究院实现多菌灵的工业化生产以来，苯并咪唑类药剂在我国应用于赤霉病已有近四十年的历史。周明国等(1999)于1992年在浙江海宁的病穗中分离到世界上首例小麦赤霉病菌对多菌灵的田间抗性菌株。近年来监测发现，在我国主要麦区已形成抗药性群体，严重影响多菌灵的防效。因此，及时快速的检测小麦赤霉菌和茎基腐菌群体对多菌灵的抗性频率，能够为杀菌剂的科学合理使用提供重要依据。镰孢菌主要通过β2微管蛋白基因点突变产生对多菌灵抗性，167位和200位苯丙氨酸转换成酪氨酸以及198位谷氨酸转换成赖氨酸或谷氨酰胺的突变能引起禾谷镰刀菌对
多菌灵的抗药性，其中167位突变为主要类型。根据突变位点信息，已报道突变扩增阻滞系统ARMS
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PCR、环介导等温扩增LAMP等方法实现抗药性的分子检测。
[0006]明确病原菌的种、毒素化学型和多菌灵抗药性对于选择适合的病害防控方案至关重要，但目前单项的检测技术方法操作仍较为繁琐，后期数据统计也需逐项人工输入，费时费力。因此，亟需集成化自动化检测技术，一次检测多个靶标，并自动输出结果，为病害防控及时提供参考信息。

技术实现思路

[0007]针对上述
技术介绍
中的不足，本专利技术提供一种基于高通量测序鉴定小麦赤霉和茎基腐病菌种、毒素类型和多菌灵抗性的检测方法，构建一个扩增子文库最多可检测384株病原菌，文库经illumina平台测序后，使用python编写的脚本将需要使用的软件串联起来，自动完成所有分析并输出结果，能一次鉴定引起两种病害的11种镰刀菌，3种毒素化学型以及4种多菌灵抗药突变基因型。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0009]S1扩增片段：采用带有barcode序列的引物扩增小麦赤霉病菌或茎基腐病菌DNA，获得TEF1α、Tri3和β
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tubulin基因目的片段；
[0010]S2高通量测序：将所有菌株的PCR产物混合，构建扩增子文库，在Illumina平台上进行高通量双端测序，每端读长为150bp；
[0011]S3测序数据拆分：使用Python脚本调用seqtk_demultiplex软件，根据菌株特异性barcode序列对测序数据进行拆分，获得单个菌株测序数据；
[0012]S4参考序列比对：使用Python脚本调用bwa2软件将每个菌株测序数据与参考序列进行比对；
[0013]S5比对文件排序：使用Python脚本调用samtools软件将比对文件转换为二进制文件，并排序；
[0014]S6覆盖度分析：使用Python脚本调用bedtools软件计算参考序列每个位点的覆盖度；
[0015]S7 SNP calling：使用Python脚本调用freebayes软件进行变异检测，根据覆盖度和质量值进行过滤；
[0016]S8基因分型：使用Python脚本统计上述结果文件，根据特异性SNP位点鉴定赤霉病菌和茎基腐病菌的种、毒素化学型以及对杀菌剂多菌灵的抗药突变类型。
[0017]作为优选的技术方案的，步骤S1根据碱基平衡及与参考序列低相似性原则，筛选获得40个barcode，可标记最多384株病原菌，因此1个扩增子文库，可包含最多384个菌株。
[0018]作为优选的技术方案的，数据分析步骤使用同一个Python脚本进行串联，使用统一的输入参数，运行脚本后可直接进行比对、排序、覆盖度分析、变异检测和基因分型鉴定等步骤。
[0019]作为优选的技术方案的，Python脚本的输入数据和参数包括输入原始数据、流程运行使用线程数、结果文件夹及文件名等，流程输出文件包括各步骤的中间数据、最终鉴定结果表格等，位于指定或默认的文件夹中
[0020]与现有技术相比，本专利技术具备以下有益效果：
[0021]1.该方法集成度高，基于高通量测序技术，能同时检测3个目的基因的2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于高通量测序鉴定小麦赤霉和茎基腐病菌种、毒素类型和多菌灵抗性的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：S1 扩增片段：采用带有barcode序列的引物扩增小麦赤霉病菌或茎基腐病菌DNA，获得TEF1α、Tri3和β
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tubulin基因目的片段；S2 高通量测序：将所有菌株的PCR产物混合，构建扩增子文库，在Illumina平台上进行高通量双端测序，每端读长为150bp；S3 测序数据拆分：使用Python脚本调用seqtk_demultiplex软件，根据菌株特异性barcode序列对测序数据进行拆分，获得单个菌株测序数据；S4 参考序列比对：使用Python脚本调用bwa2软件将每个菌株测序数据与参考序列进行比对；S5 比对文件排序：使用Python脚本调用samtools软件将比对文件转换为二进制文件，并排序；S6 覆盖度分析：使用Python脚本调用bedtools软件计算参考序列每个位点的覆盖度；S7 SNP calling：使用Python脚本调用freebayes软件进行变异检测，根据覆盖度和质量值进行过滤；S8 基因分型：使用Python脚本统计上述结果文件，根据特异性SNP位点鉴定赤霉病菌和茎基腐病菌的种、毒素化学型以及对杀菌剂多菌灵的抗药突变类型。2.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序鉴定小麦赤霉和茎基腐病菌种、毒素类型和多菌灵抗性的检测方法，其特征在于：步骤S1中扩增目的基因片段所采用的引物为：EF1S
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F：CTCATTTTCCTCGATCGCSCEF1S
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R：CTCGGCGGCTTCCTATTGWCTRI3F：AACCTGAGCCCTCCAGTCGTTRI3R：CGAGTATRATSGCAGCTTGGGTUB2F：GCTGACGCACTCTCTCGGCGTUB2R：CGGCCATGACGGTGGAAATC。3.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序鉴定小麦赤霉和茎基腐病菌种、毒素类型和多菌灵抗性的检测方法，其特征在于：步骤S1中扩增目的基因片段所采用的引物5
’
端增加6个碱基组成的barcode序列，用于区分不同菌株，共有24组正向引物barcode序列和16组反向引物barcode序列，排列组合后最多能标记区分384株病原菌，barcode序列为：F1：AAGCGCF2：ATACGGF3：ATGGACF4：ATCGGAF5：AGTACTF6：AGGCACF7：AGCGCTF8：ACTAGCF9：ACGTATF10：ACCTAT
F11：TATGACF12：TAGGACF13：TACTACF14：TTAGCGF15：TTCCAGF16：TGTAGAF17：TGCAACF18：TGCCGTF19：TCTACAF20：TCCAGAF21：GATACTF22：GAGTTAF23：GACGTTF24：GTACTAR1：GTGCCAR2：GGATTAR3：GGCACAR4：GCAGTTR5：GCTGTAR6：GCCTGAR7：CATGAGR8：CAGGACR9：CTAATGR10：CTAGCGR11：CTGACTR1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张昊，杨美欣，冯洁，徐进，许景升，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：