一种马铃薯晚疫病恒温分子检测标记引物及检测方法技术

本发明专利技术公开一种马铃薯晚疫病恒温分子检测标记引物及检测方法，所述分子标记引物包括序列表SEQ ID NO：1～3所示的上游引物RAA

【技术实现步骤摘要】
一种马铃薯晚疫病恒温分子检测标记引物及检测方法


[0001]本专利技术属于马铃薯晚疫病基因检测领域，涉及等温扩增检测技术。

技术介绍

[0002]马铃薯晚疫病每年造成的经济损失巨大，如何有效防控该病害至今仍是全球共同面临的问题。
[0003]传统的晚疫病检测方法包括观察发病症状和分离病原物进行形态学鉴定两种。然而直接观察容易遗漏发病初期的植物材料，且致病疫霉引发的病害易与Pythium spp.，Fusarium spp.和Rhizoctonia spp.引起的病害症状混淆。因此，分离得到致病疫霉菌是非常有必要的。但致病疫霉的分离纯培养有较高的技术要求，且可用于病菌鉴定的形态学特征很少，鉴定起来也比较困难。
[0004]分子检测的出现为植物病害的快速、准确诊断提供了新的思路和方法。但基于转录间隔区(ITS)、线粒体基因Cox1
‑
Cox2等靶标的分子检测技术受限于序列差异小、GC含量高等原因，难以将靶标疫霉菌与其近缘种区分开或不适宜于用作分子靶标。
[0005]PCR检测体系依赖于PCR仪等精密设备，且对实验环境及操作人员的专业水平要求较高，耗时较长，难以脱离实验室，难以实现大田现场检测。
[0006]与常规PCR技术相比，等温扩增技术操作简单、扩增时间短，无需精密的仪器和设备。目前比较常见的等温扩增技术有依赖核酸序列的扩增技术(Nuclear acid sequence
‑
based amplification，NASBA)、滚环扩增技术(Rolling circle amplification，RCA)、依赖解旋酶DNA等温扩增技术(Helicase
‑
dependent Isothermal DNA Amplification，HDA)、环介导恒温扩增技术(Loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP)、重组酶聚合酶扩增技术(Recomninase polymerase amplification，RPA)等。
[0007]赵玉梅等基于Ypt1建立的马铃薯晚疫病RPA
‑
LFD检测体系在模板浓度为40ng/μL时，扩增5min时试纸条上未见检测线，扩增10min时检测线仍很微弱。Mehran Khan等基于Ypt1建立的致病疫霉LAMP检测技术的最低检出限为128fg/μL。Gaurav Verma等基于ITS
‑
1建立的致病疫霉LAMP体系检测灵敏度为1pg/μL。并且，LAMP检测技术的扩增时间通常都在60min以上。
[0008]重组酶介导的扩增(Recomninase aided amplification，RAA)技术是国内企业研发的一种与RPA相似的技术，二者的区别仅在于重组酶的来源不同。RPA技术中的重组酶来自T4噬菌体，而RAA技术中的重组酶来自细菌或真菌。与T4噬菌体相比，RAA中所用的重组酶来源更广，对温度的适应性也更高。现有技术中，还没有针对马铃薯晚疫病致病疫霉开发具有特异性的RAA恒温分子检测引物与探针。

技术实现思路

[0009]鉴于此，本专利技术目的在于设计具有物种特异性的RAA恒温分子检测引物与探针，并进一步地开发高特异性、高灵敏度的马铃薯晚疫病RAA恒温检测体系。
[0010]专利技术人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本专利技术提供的技术方案是，提供一种马铃薯晚疫病恒温分子检测标记引物，所述分子标记引物为：
[0011]上游引物RAA
‑
Pi1F(5'to3')：ACCTGCTCATACTAATTCGTCTCCGAAATTG；
[0012]下游引物RAA
‑
Pi1R(5'to3')：Bio
‑
TCAAATATCAATGTAGTGATAGTGATACAGC；
[0013]Pi
‑
Probe探针(5'to3')：(6
‑
Carboxyfluorescein)
‑
AGTGGACTAATGCGTTGACGTCTTCGA CGC
‑
(THF)
‑
GATACTATTGCAGGC
‑
(SpacerC3)。
[0014]根据本专利技术马铃薯晚疫病恒温分子检测标记引物的一个实施方式，所述分子标记引物用于鉴定致病疫霉。
[0015]本专利技术还提供了一种基于前述分子检测标记引物的恒温分子检测方法，以待测马铃薯叶片样本材料基因组DNA作为模板，用RAA
‑
Pi1F/RAA
‑
Pi1R引物和Pi
‑
Probe探针进行RAA扩增，扩增产物在凝胶电泳或LFD试纸条上检测，出现阳性条带则表明待测马铃薯叶片样本含有致病疫霉的DNA。
[0016]优选地，所述扩增的温度条件为35.0℃～39.0℃。
[0017]优选地，扩增的温度条件为37.0℃。
[0018]优选地，所述扩增的时长为5～25min。
[0019]优选地，所述扩增的时长为10～20min。
[0020]与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：
[0021]a)本专利技术设计的RAA扩增引物与探针经与NCBI的核酸序列数据库进行比对，确定具有物种特异性。
[0022]b)本专利技术检测方法的灵敏度高，扩增时间为10min时，RAA
‑
LFD的最低检测下限为1fg/μL；扩增时间为15min时，RAA
‑
LFD的最低检测下限为5
×
10
‑2fg/μL；扩增时间为20min时，RAA
‑
LFD的最低检测下限为1
×
10
‑3fg/μL；扩增时间为25min时，RAA
‑
LFD的最低检测下限为1
×
10
‑4fg/μL，换算成模板分子拷贝数为27.4copies/mL。
附图说明
[0023]为了更清楚地说明本专利技术实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0024]图1是RAA
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LFD体系引物有效性和特异性检测结果。图1中A、B分别为RAA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳和LFD检测；C：控制线；T：检测线；M：DNA marker；CK
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：空白对照ddH2O；1：马铃薯脱毒苗；2：茄科雷尔氏菌；3：大豆疫霉；4：烟草疫霉；5：芋疫霉；6：辣椒疫霉菌；7：致病疫霉。
[0025]图2是RAA
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LFD本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种马铃薯晚疫病恒温分子检测标记引物，其特征在于，所述分子标记引物为：上游引物RAA
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Pi1F(5'to3')：ACCTGCTCATACTAATTCGTCTCCGAAATTG；下游引物RAA
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Pi1R(5'to3')：Bio
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TCAAATATCAATGTAGTGATAGTGATACAGC；Pi
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Probe探针(5'to3')：(6
‑
Carboxyfluorescein)
‑
AGTGGACTAATGCGTTGACGTCTTCGACGC
‑
(THF)
‑
GATACTATTGC AGGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶向，雍彬，唐雪，李洪浩，黄维藻，
申请(专利权)人：四川儒愿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：