测量KRAS蛋白抑制的方法技术

本文提供了测量KRAS蛋白功能抑制的方法及在其方法中使用的化合物的合成方法。及在其方法中使用的化合物的合成方法。

【技术实现步骤摘要】
测量KRAS蛋白抑制的方法


[0001]本文提供了测量KRAS蛋白功能抑制的方法及在其方法中使用的化合物的合成方法。

技术介绍

[0002]Ras是一个蛋白质家族，其通过其C末端膜靶向区与细胞膜相关并且作为细胞内信号传导网络中的分子开关而众所周知(Cox AD,Der CJ.Ras history:The saga continues[Ras历史：传奇仍在继续].Small GTPases[小GTP酶].2010；1(1):2
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27)。Ras蛋白与GTP或GDP结合，并在“开启”和“关闭”状态之间切换。当Ras蛋白与GDP结合时，它处于关闭(或无活性)状态。并且当Ras被某些促生长刺激物(如生长因子)开启时，将诱导Ras蛋白将其结合的GDP交换为GTP并且变成开启(或活性)状态(Malumbres M,Barbacid M.RAS oncogenes:the first 30 years[Ras癌基因：前30年].Nat Rev Cancer[癌症自然评论]2003；3(6):459
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465)。通过切换到活性状态，Ras蛋白可以与不同的下游蛋白相互作用，并激活相关的信号传导途径(Berndt N,Hamilton AD,Sebti SM.Targeting protein prenylation for cancer therapy[靶向蛋白质的异戊二烯化进行癌症治疗].Nat Rev Cancer[癌症自然评论].2011；11(11):775
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791)。Ras超家族含有不同的亚家族，包括Ras、Ral、Rap、Rheb、Rad、Rit和Miro(Wennerberg K,Rossman KL,Der CJ.The Ras superfamily at a glance[Ras超家族一览].J Cell Sci[细胞科学杂志]2005；118(第5部分):843
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846)。HRas、NRas和KRas是Ras家族中研究最充分的蛋白质，因为这些蛋白质是人类癌症中最常见的癌基因(O'Bryan JP.Pharmacological targeting of RAS:Recent success with direct inhibitors[Ras的药理学靶向：直接抑制剂的最新成功].Pharmacol Res[药理学研究].2019；139:503
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511)。
[0003]KRas是人类癌症中最常见的突变基因之一。基于体细胞突变目录(COSMIC)数据库的数据，KRas突变可见于约20％的人类癌症，包括胰腺癌、结直肠癌、肺癌、皮肤癌等(O'Bryan JP.Pharmacological targeting of RAS:Recent success with direct inhibitors[RAS的药理学靶向：直接抑制剂的最新成功].Pharmacol Res[药理学研究].2019；139:503
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511)。并且发现最常见的KRas突变位于G12和G13位置处，这些突变阻断GTP酶激活蛋白(GAP)刺激的KRas的GTP水解活性(Wang W,Fang G,Rudolph J.Ras inhibition via direct Ras binding
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is there a path forward？[经由直接Ras结合的Ras抑制——是否有前进的道路？]Bioorg Med Chem Lett[生物有机化学与药物化学快报].2012；22(18):5766
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5776)。这导致KRas蛋白的过度激活，并且最终导致失控的细胞增殖和癌症。
[0004]在不同癌症中，胰腺癌被认为是KRas上瘾程度最高的癌症类型。KRas突变发现于94.1％的胰腺导管腺癌(PDAC)中。KRas的G12D(41％)和G12V(34％)突变是所有KRas突变的PDAC中最主要的两种突变(Waters AM,Der CJ.KRAS:The Critical Driver and Therapeutic Target for Pancreatic Cancer[KRAS：胰腺癌的关键驱动因素和治疗靶标].Cold Spring Harb Perspect Med[冷泉港医学展望].2018；8(9):a031435)。由小鼠模
型生成的体内数据证明胰腺癌的进展和维持高度依赖于KRas下游信号传导的组成性激活(Siveke JT,Schmid RM.Chromosomal instability in mouse metastatic pancreatic cancer
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it's Kras and Tp53 after all[小鼠转移性胰腺癌中的染色体不稳定性——竟然是Kras和Tp53].cancer Cell[癌细胞].2005；7(5):405
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407)。这表明突变的KRas蛋白是胰腺癌和其他具有KRas突变的癌症的非常有吸引力的药物靶标。因为WT KRas蛋白在正常组织的功能中也起着关键作用，并且证明WT KRas功能对成人造血作用至关重要(Malumbres M,Barbacid M.RAS oncogenes:the first 30 years[Ras癌基因：前30年].Nat Rev Cancer[癌症自然评论]2003；3(6):459
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465)。一种潜在的药物分子可以选择性地抑制癌细胞中突变的Kras蛋白并使其在正常细胞中的WT伴侣不受影响，这是非常值得的。因为Kras蛋白通常被认为是不可成药靶标，因此临床上没有可以选择性地靶向具有G12D突变的Kras蛋白的疗法。
[0005]药物分子可以采取两种策略来选择性地消除由Kras突变诱导的过度激活的Kras信号传导。一种方式是直接与突变的Kras蛋白结合，通过稳定其GDP结合形式(无活性形式)，或通过阻断GTP结合形式与其下游靶蛋白之间的相互作用。另一种策略是劫持细胞中的蛋白质降解机制并通过称为蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)的双功能分子来充分利用E3连接酶(如VHL、CRBN或IAP)的底物特异性(Winter GE,Buckley DL,Paulk J,Roberts JM,Souza A,Dhe
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Paganon S,Bradner JE.DRUG DEVELOPMENT.Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation[药物开发，作为体内靶蛋白降解策略的邻苯二甲酰亚胺缀合].Science[科学],2015年6月19日；348(6241):1376
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81)。蛋白水解靶向嵌合体可以与突变的Kras蛋白和E3连接酶两者结合，在这两种蛋白质之间产生相互作用并诱导Kras降解。
[0006]因此，KRa本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测试KRAS抑制剂活性的方法，该方法包括(i)将KRAS蛋白与待测化合物一起孵育；(ii)孵育后，将KRAS蛋白的生物素化探针(I)添加到(i)的系统中，KI部分是KRAS抑制剂部分；接头是KI部分与生物素之间的二价接头；生物素是用酰胺基团或酯基团来与接头部分连接的生物素部分；(iii)将Mab抗GST
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Tb穴状化合物和链霉亲和素
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XL665添加到(ii)的系统中；以及(iv)通过使用光作为入射光来读取两个不同波长的TR
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FRET信号作为系统(iii)的发射光；并基于荧光的比率计算该化合物的KRAS抑制剂活性。2.如权利要求1所述的方法，其中该KRAS蛋白是负载GDP的KRAS蛋白；优选地，KRAS蛋白是WT KRAS蛋白或KRAS G12D蛋白；优选地，KRAS蛋白是带GST标签的负载GDP的WT KRAS或带GST标签的负载GDP的KRAS G12D。3.如权利要求2所述的方法，其中该WT KRAS蛋白浓度是1
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5nM或KRAS G12D蛋白浓度是0.1
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0.9nM；优选地，WT KRAS蛋白浓度是2
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4nM或KRAS G12D蛋白浓度是0.3
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0.8nM；优选地，WT KRAS蛋白浓度是3nM或KRAS G12D蛋白浓度是0.5nM。4.如权利要求1所述的方法，其中该KI部分选自野生型KRAS抑制剂部分或KRAS G12D抑制剂部分；优选地，KI部分选自制剂部分；优选地，KI部分选自5.如权利要求1所述的方法，其中该接头部分选自其中*是指附接到KI部分的位置，并且**是指附接到该生物素部分的位置。6.如权利要求1所述的方法，其中该生物素部分是7.如权利要求1所述的方法，其中该生物素化探针(...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵文轲，张慧，郑磊，徐西国，
申请(专利权)人：百济神州北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：