公开了在单次质谱(MS)运行中量化多个样品的多个质量属性(例如翻译后修饰)的方法，包括在足以消化样品的条件下将两个或更多个样品与消化溶液接触，其中每个样品被单独消化并且消化溶液为不含Tris的缓冲溶液；在足以用特异性串联质量标签(TMT)标记试剂标记消化样品中的每一个内的肽的条件下，使两个或更多个消化样品中的每一个与特异性TMT标记试剂接触；对两个或更多个消化样品中的每一个中的肽进行淬灭标记；将等体积的两个或更多个标记、消化的样品合并成单个组合样品溶液；和通过靶向质谱分析，分析所述单个组合样品溶液，从而允许在单个质谱(MS)运行中量化两个或更多个样品的多个质量属性。品的多个质量属性。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】蛋白质翻译后修饰的串联质谱标记多重定量
[0001]对序列表的参考
[0002]本申请通过引用并入以计算机可读形式作为文件10693WO01
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Sequence.txt提交的序列表，其创建于2021年1月26日并含有1462个字节。
[0003]本专利技术涉及生物制药，并且涉及对蛋白质如治疗性单克隆抗体的翻译后修饰的串联质量标签(TMT)多重定量。
技术介绍
[0004]自1986年美国食品药品监督管理局(FDA)首次批准以来，重组单克隆抗体(mAb)已成为药物开发管道和生物制药药品市场中治疗各种人类疾病的最快速增长的生物治疗药物类别之一，这是由于与小分子药物相比，其特异性高、循环半衰期长、引发免疫细胞效应反应的可能性以及副作用少。迄今为止，约有80种IgG mAb药物产品已获得FDA和欧洲药品管理局(EMA)的批准，并且70多种处于后期开发阶段。
[0005]IgG mAb是大约150kDa的共价异四聚体蛋白，由两条相同的重链和轻链组成，它们通过多个二硫键共价连接形成Y形结构。由于其大尺寸和结构复杂性，mAb易受多种翻译后修饰(PTM)的影响，例如在细胞培养、纯化、配制和储存过程中的Fc糖基化、蛋氨酸(Met)氧化、天冬酰胺(Asn)脱酰胺、天冬氨酸(Asp)环化/异构化、N端谷氨酰胺(Gln)或谷氨酸(Glu)环化、C端赖氨酸(Lys)剪裁、非酶促赖氨酸糖化和三硫键。PTM可能是结构异质性的主要来源，并在调节mAb的理化性质中发挥重要作用。一些PTM，如糖基化、脱酰胺化和氧化，取决于受影响残基的位置(例如，在互补决定区(CDR)中)，甚至可能对稳定性、功能、免疫原性和药代动力学/药效学产生不利影响，这些通常被认为是在药物开发过程中用于密切监测的抗体的关键质量属性(CQA)(Wang et al.,J.Pharm.Sci.2007,96,1
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26；Manning et al.,Pharm Res.2010,27,544
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557)。大多数IgG抗体中位于重链恒定结构域2(CH2)和3(CH3)界面的两个保守Met残基的氧化会降低热稳定性(Houde et al.,Mol.Cell.Proteomics.2010,9,1716
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1728)、蛋白A结合(Bertolotti
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Ciarlet et al.,Mol.Immunol.2009,46,1878
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1882)、FcRn结合(Zhang et al.,Anal.Chem.2014,86,3468
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3475)和IgG抗体的循环半衰期(Wang et al.,Mol.Immunol.2011,48,860
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866)，而在溶剂暴露的CDR中Met或色氨酸(Trp)氧化和Asn脱酰胺可能影响抗原结合和效力(Wei et al.,J.Pharm.Sci.2009,98,3509
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3521；Yan et al.,J.Pharm.Sci.2009,98,3509
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3521)。抗体的Fc区内重链CH2的保守Asn处的N连接糖基化对于维持mAb结构和稳定性也很重要，并且在某些情况下可以通过调节与F
C
γ受体的结合调节下游效应器功能，例如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(Jennewein,M.F.；Alter,G.Trends in Immunology.2017,38,358
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372)。因此，必须表征和控制PTM的水平，特别是那些在治疗性抗体的开发、生产和储存过程中被视为CQA的水平，以确保产品质量并确定对最终安全性和效力的任何潜在影响。
[0006]使用液相色谱
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质谱(LC
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MS)进行肽图分析在生物制药行业中用于在分子水平上表征治疗性抗体(Beck et al.,Anal.Chem.2013,85,715
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736；Sandra,K.et al.,J.Chromatogr.A.2014,1335,81
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103)。该方法采用自下而上的方法，包括在非还原(非还原肽图分析)或还原(还原肽图分析)条件下对蛋白质进行酶(即通常为胰蛋白酶)消化，然后分离所得肽并通过紫外线(UV)检测和/或质谱(MS)进行分析，提供评估由链间和链内二硫键维持的结构完整性、确认蛋白质氨基酸序列以及提供在生产、加工或储存过程中可能出现的翻译后和化学修饰时位点特异性定量的优势(Mouchahoir,T.；Schiel,J.E.Anal.Bioanal.Chem.2018,410,2111
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2126)。
[0007]在用于PTM分析的基于LC
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MS的肽图分析方法中，通过计算含有PTM的修饰肽的所提取离子色谱(EIC)峰面积与相应的天然肽和修饰肽的EIC峰面积总和的比率，从酶消化的MS1光谱中量化位点特异性PTM。尽管由于LC
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MS仪器和生物信息学软件的快速发展，简化的肽图分析工作流程可以在单次LC
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MS运行中产生高序列覆盖率并有效表征抗体样品的多个属性(例如，不同的位点特异性PTM)，但这种用于对位点特异性PTM进行相对定量的传统无标记方法需要对单个样品进行样品制备和质谱数据采集，这可能需要大量时间，因此难以适应药物开发期间对单克隆抗体表征不断增长的需求。肽图分析技术的最新研究进展主要集中在提高样品制备效率，例如开发自动化系统以提高通量或在线消化系统以减少样品制备时间(Richardson et al.,Anal.Biochem.2011,411,284
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291；Cao et al.,J.Pharm.Sci.2019,108,3540
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3549；and Mao et al.,mAbs.2019,11,767
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778)，但是当样品量增加时，样品的LC
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MS数据采集所需的仪器时间也会线性增加，这不仅限制了用于蛋白质表征的肽图分析工作流程的整体效率，而且可能带来PTM定量的大可变性，这种可变性由在肽图分析中的消化物的LC
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MS分析期间与时间和温度相关的仪器波动、仪器硬件和软件故障或自动进样器中的样品储存稳定性导致的。
技术实现思路
[0008]在一个方面，本专利技术提供了一种在单次质谱(MS)运行中量化多个样品的多个质量属性的方法，包括：在足以消化两个或更多个样品的条件下将两个或更多个样品与消化溶液接触，其中每个样品被单独消化并且消化溶液为不含Tris的缓冲溶液；在足以用特异性TMT标记试剂标记两个或更多个消化样品中的每一个内的肽的条件下，使两个或更多个消化样品中的每一个与特异性串联质量标签(TMT)标记试剂接触；对两个或更多个消化样品中的每一个中的肽进行淬灭标记；将等体积的两个或更多个标记、消化本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在单次质谱(MS)运行中量化多个样品的多个质量属性的方法，包括：在足以消化两个或更多个样品的条件下使两个或更多个样品与消化溶液接触，其中每个样品单独消化并且所述消化溶液是不含Tris的缓冲溶液；在足以用特异性串联质量标签(TMT)标记试剂标记所述两个或更多个消化样品中的每一个内的肽的条件下，使所述两个或更多个消化样品中的每一个与所述特异性TMT标记试剂接触；对所述两个或更多个消化样品中的每一个中的肽进行淬灭标记；将等体积的所述两个或更多个标记的、消化的样品合并成单个组合样品溶液；和通过靶向质谱分析法分析所述单个组合样品溶液，从而允许在单次MS运行中量化所述两个或更多个样品的多个质量属性。2.根据权利要求1所述的方法，其中多个质量属性包括翻译后修饰(PTM)。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述PTM包括脱酰胺、氧化、糖化、二硫化物形成、N
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末端焦谷氨酸形成、C
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末端赖氨酸去除和糖基化中的一种或多种。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述PTM包括糖基化。5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中在单次MS运行中量化多个质量属性包括通过从靶向质谱中生成的所得报告离子的提取峰面积量化PTM的相对丰度来量化PTM。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，还包括在将所述两个或更多个消化样品中的每一个与特定TMT标记试剂接触之前，使所述两个或更多个消化样品中的每一个与小分子添加剂接触。7.根据权利要求5所述的方法，其中所述小分子添加剂选自BOC
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Y
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OH、对甲酚、羟基苯乙酸(HPAA)、羟基苯甲酸(HBA)、对乙酰氨基酚和对氨基苯甲酸(PABA)。8.根据权利要求6所述的方法，其中所述小分子添加剂是PABA。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述肽是糖肽。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述糖肽获自单克隆抗体。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述单克隆抗体是同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或混合同种型。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述两个或更多个样品在2个至11个样品之间。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，进一步包括获得两个或更多个待分析的样品。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，还包括在足以消化所述两个或更多个样品的条件下使所述两个或更多个样品与消化溶液接触之前制备所述两个或更多个样品用于消化。15.根据权利要求14所述的方法，其中在消化之前制备所述两个或更多个样品包括在允许样品变性和还原的条件下使所述两个或更多个样品中的每一个与变性和还原溶液接触；以及在允许样品烷基化的条件下将所述两个或更多个变性和还原的样品中的每一个与烷基化溶液接触。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中通过靶向质谱分析法分析所述单个组合样品溶液包括将所述单个组合样品施加到分离柱并对洗脱的样品组分进行靶向质谱
分析。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述分离柱是液相色谱柱。18.根据权利要求16或17所述的方法，其中对洗脱的样品组分进行靶...
【专利技术属性】
技术研发人员：茅源，A，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：
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