本发明专利技术属于微生物制药技术领域，具体公开了一种提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法，本发明专利技术通过补加关键物质肌肽，补加葡萄糖、进行培养基配方设计、分阶段控制温度与pH的控制，对发酵工艺进行精确调控，有效提升了发酵单位、提升有效组分含量，从而提升了发酵液质量。与对照例相比，发酵单位与有效组分含量均有明显提升，发酵单位最高提高了29.42％，有效组分提高了12.32％。有效组分提高了12.32％。有效组分提高了12.32％。
【技术实现步骤摘要】
一种提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法
[0001]本专利技术涉及微生物制药
，特别是一种提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法。
技术介绍
[0002]多粘菌素B是一类相对分子量较大的脂肽类分子，由B1、B2、B3和B1
‑
I四个主要组分组成。多粘菌素B为抗革兰阴性杆菌多肽类抗生素，可以改变膜结构使小分子物质泄漏而抑制革兰氏阴性菌的生长，结合到细菌脂多糖类的脂质部分，在外皮细胞膜诱发小孔。其几乎对所有革兰氏阴性菌均有较强的抑制和杀菌作用，如大肠杆菌、绿脓杆菌、副大肠杆菌、肺炎克雷白杆菌、嗜酸杆菌、百日咳杆菌及痢疾杆菌等，尤其对绿脓杆菌有显著作用。由于多粘菌素B对革兰氏阴性耐药菌良好的抗菌活力，近年来成为抗耐药菌药物领域的研究热点。
[0003]因多粘菌素B产物为多组分，各组分含量控制是发酵控制过程的难点。其中要求有效组分含量达到(B1、B2、B3、B1
‑
I总含量)80％以上，且要求B3≤6％，BI
‑
I≤18％，最大单杂≤3％，总杂≤17％。发酵液质量是影响最终成品的关键因素，其中发酵液中各组分含量满足要求，且有效组分含量之和高、发酵单位高，在此基础上进行提取纯化的难度小、收率更高，为清洁生产提供数据支持。
[0004]目前我国多粘菌素B发酵水平较低，行业发酵单位约2g/L左右，而国外2007年发酵单位即可达到2.8g/L，有较大的差距。另外，多粘菌素B在提高有效组分含量、降低杂质含量的研究相对较少，影响有效组分总含量的因素不明确，发酵液中的含量偏低。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法，以提高发酵液中的多粘菌素B发酵单位和有效组分含量。
[0006]为达到上述目的，本专利技术是按照以下技术方案实施的：
[0007]一种提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法，包括以下步骤：
[0008]S1、将生长良好的多粘芽胞杆菌种子罐液按照发酵罐接后体积10％的量接种到发酵培养基中，接种前通气为0.6vvm，罐压为0.04MPa
‑
0.06MPa，转速为200
‑
500rpm，30≤溶氧≤40％；
[0009]S2、发酵0h
‑
12h期间，控制发酵罐内温度为30
‑
32℃，通过补入补料一以控制发酵罐内pH为6.5
‑
6.7；发酵13h
‑
60h期间，控制发酵罐内温度为27
‑
29℃，每小时补入0.0001
‑
0.0003倍的发酵液体积的补料二，同时通过补入补料一以控制发酵罐内pH为6.1
‑
6.3。
[0010]进一步地，还包括：
[0011]S3、发酵30h后每小时恒速补入0.002
‑
0.004倍的发酵体积的补料三，培养至60h。
[0012]进一步地，所述步骤S1中发酵培养基为：每100mL发酵培养基由以下重量的组分组成：小麦全麦粉6.0g
‑
8.0g，α淀粉酶0.01g
‑
0.02g，葡萄糖0.3g
‑
0.5g，低温豆粉1.5g
‑
2.5g，
玉米浆0.4g
‑
0.6g，硫酸铵0.6g
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0.8g，磷酸二氢钾0.025g
‑
0.035g，大豆卵磷脂0.05g
‑
0.15g，碳酸钙0.3g
‑
0.5g，消泡剂0.1g
‑
0.2g，其余为水。
[0013]进一步地，所述补料一是浓度为20％的氨水。
[0014]进一步地，所述补料二是灭菌后的浓度为5％(W/V)的肌肽溶液。
[0015]进一步地，所述补料三为灭菌后浓度为50％(W/V)葡萄糖溶液。
[0016]优选地，所述步骤S1中发酵培养基为：每100mL发酵培养基由以下重量的组分组成：小麦全麦粉7.0，α淀粉酶0.015，葡萄糖0.4，低温豆粉2.0，玉米浆0.5，硫酸铵0.7，磷酸二氢钾0.03，大豆卵磷脂0.1，碳酸钙0.4，消泡剂0.15，其余为水。
[0017]优选地，所述发酵0h
‑
12h期间，控制发酵罐内温度为31℃；发酵13h
‑
60h期间，控制发酵罐内温度为28℃。
[0018]优选地，发酵0h
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12h期间，控制发酵罐内pH为6.6；发酵13h
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60h期间，控制发酵罐内pH为6.2。
[0019]与现有技术相比，本专利技术通过补加关键物质肌肽，补加葡萄糖、进行培养基配方设计、分阶段控制温度与pH的控制，对发酵工艺进行精确调控，有效提升了发酵单位、提升有效组分含量，从而提升了发酵液质量。与对照例相比，发酵单位与有效组分含量均有明显提升，发酵单位最高提高了29.42％，有效组分提高了12.32％。
附图说明
[0020]图1为对照例1发酵液高效液相色谱图；
[0021]图2为实施例4发酵液高效液相色谱图。
具体实施方式
[0022]为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利技术，并不用于限定专利技术。
[0023]实施例1
[0024]步骤(1)
[0025]配制发酵培养基：(以g/100mL为单位计算)：小麦全麦粉7.0，α淀粉酶0.015，葡萄糖0.4，低温豆粉2.0，玉米浆0.5，硫酸铵0.7，磷酸二氢钾0.03，大豆卵磷脂0.1，碳酸钙0.4，消泡剂0.15，其余为水；
[0026]步骤(2)
[0027]将生长良好的多粘芽胞杆菌种子罐液，按照发酵罐接后体积10％的量，接种到上述发酵培养基中，接种前控制发酵罐内：通气比为0.6vvm，罐压0.04MPa
‑
0.06MPa，转速200
‑
500rpm，通过调整转速控制溶氧30％
‑
40％；
[0028]步骤(3)
[0029]发酵周期在0h
‑
12h：控制温度30℃，通过补入浓度为20％的氨水控制pH为6.7。发酵周期13h
‑
60h控制温度29℃，补加灭菌后的浓度为5％(W/V)的肌肽溶液(每小时补入0.0001倍的发酵体积)、同时通过补入浓度为20％的氨水控制pH为6.3；培养至60h，即得到最终发酵液，最终发酵液经高效液相色谱检测，结果如下表所示：
[0030][0031]实施例2
[0032]步骤(1)
[0033]配制发酵培养基：(以g/100mL为单位计算)：小麦全麦粉7.0，α淀粉酶0.015，葡萄糖0.4，低温本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将生长良好的多粘芽胞杆菌种子罐液按照发酵罐接后体积10％的量接种到发酵培养基中，接种前通气为0.6vvm，罐压为0.04MPa
‑
0.06MPa，转速为200
‑
500rpm，30≤溶氧≤40％；S2、发酵0h
‑
12h期间，控制发酵罐内温度为30
‑
32℃，通过补入补料一以控制发酵罐内pH为6.5
‑
6.7；发酵13h
‑
60h期间，控制发酵罐内温度为27
‑
29℃，每小时补入0.0001
‑
0.0003倍的发酵液体积的补料二，同时通过补入补料一以控制发酵罐内pH为6.1
‑
6.3。2.根据权利要求1所述的提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法，其特征在于，还包括：S3、发酵30h后每小时恒速补入0.002
‑
0.004倍的发酵体积的补料三，培养至60h。3.根据权利要求1所述的提高多粘菌素B有效组分含量的发酵液制备方法，其特征在于，所述步骤S1中发酵培养基为：每100mL发酵培养基由以下重量的组分组成：小麦全麦粉6.0g
‑
8.0g，α淀粉酶0.01g
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0.02g，葡萄糖0.3g
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0.5g，低温豆粉1.5g
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2.5g，玉米浆0.4g
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0.6g，硫酸铵0.6g
【专利技术属性】
技术研发人员：于立超，李猛，徐珍，
申请(专利权)人：河北圣雪大成制药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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