一种微珠芯片离心制备方法技术

本发明专利技术涉及生物芯片技术领域，具体是一种微珠芯片离心制备方法，包括以下步骤：A、蚀刻：B、离心装载：C、离心稳固。采用本发明专利技术的微珠芯片离心制备方法能够显著提高微球入孔率，使其达到99％以上，可以使微球入孔更深，更利于后期的实验操作，采用稳固装置进行微球稳定离心操作时，可以很好的避免芯片在离心过程中的脱落或者移位，保证每次稳固操作的一致性，也使原有入孔的微球更加稳固，不易在后续的实验步骤中脱落。骤中脱落。

【技术实现步骤摘要】
一种微珠芯片离心制备方法


[0001]本专利技术涉及生物芯片
，具体地说，是一种微珠芯片离心制备方法。

技术介绍

[0002]伴随着近年来国内基因检测行业的迅速发展，高密度基因芯片凭借其检测灵敏度、可靠性及便捷性，目前已广泛用于各个相关领域。
[0003]高密度基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。高密度基因芯片以硅板作为基体，硅板表面有超过3亿个小孔，每个小孔用来固定一个微球。微球是核酸探针的固定载体，由二氧化硅制成，粒径在500nm～5um形状为球状物。
[0004]微球铺入硅板是使用基因芯片进行基因检测时的重要步骤。需要将已经与寡核苷酸探针耦连的微球装载并固定在上述硅板中的小孔上，然后将已装载微球的硅片进行一系列处理，并与待检测DNA样品杂交，进行检测。如何提高微珠的铺入率是生物芯片生产过程中的难点之一。
[0005]铺入微球后，硅板在后续处理中会受到一系列外力的影响，导致已装载微球的掉落。而最终检测结果由微球耦连的寡核苷酸探针所释放的信号判断，微球的掉落会影响结果的准确性。因此，提高微球入孔率，是提高检测结果准确性的重要手段。
[0006]现有铺入方式得到的芯片，如果微球是采用接触式的方式铺入芯片，可能对微球上面的修饰基团造成污染，并且传统的非接触式微球铺入方式由于没有外力挤压，微球入孔深度较浅，在后续的操作中容易脱落，导致后期有效信号减少。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种微珠芯片离心制备方法，以解决现有技术中微珠入孔率低、稳定性差的技术问题。
[0008]本专利技术的第一方面，提供一种微珠芯片离心制备方法，包括以下步骤：
[0009]A、蚀刻：
[0010]将光刻胶均匀旋涂到单晶硅板表面致使形成一层均匀的薄膜，利用光刻机将掩膜板上的图案转移到光刻胶上，在光刻胶镂空的部分用等离子蚀刻技术在硅板表面蚀刻出密集排列的直径与二氧化硅微球近似的小孔；
[0011]B、离心装载：
[0012]使用硅板固定装置固定二氧化硅微球溶液和空白硅板，所述的硅板固定装置包括用于夹紧固定硅板的上板和下板，下板上表面设有与硅板大小相对应的凹槽；将二氧化硅微球溶液加入凹槽内，将空白硅板样本位向下扣在下板凹槽上方，将上板和下板固定锁紧(图1)；然后将硅板固定装置固定在96孔板离心机中(下板在下，上板在上)，在8000
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10000xg(优选8000xg)离心力下离心10
‑
15min；离心后将硅板取出，并用大量去离子水清洗硅板表面3次；完成二氧化硅微球的装载；
[0013]C、离心稳固：
[0014]将已装载二氧化硅微球的硅板放入稳固装置的凹槽中(图2)，样本位向上；然后将稳固装置固定在96孔板离心机中，在5000
‑
10000xg(优选5000xg)离心力下离心5
‑
10min；离心后将硅板取出，并用大量去离子水清洗硅板表面3次。
[0015]进一步的，所述的步骤A中，小孔的深度约为1um～2um。
[0016]进一步的，所述的步骤B中，硅板固定装置的下板长90mm，宽45mm，高10mm；上表面中间的凹槽长70mm，宽20mm，深度2mm；凹槽外侧设有宽度1mm左右，深度1mm的条形槽，里面嵌入尺寸相当的密封条，密封条外设有四个对称的螺纹孔，用于和上板固定锁紧。
[0017]硅板固定装置的上板长90mm，宽45mm，高10mm；与下板对应位置设有四个对称的螺纹孔，用于和下板固定锁紧。
[0018]进一步的，所述的步骤B中，硅板固定装置的上板和下板用螺钉固定锁紧。
[0019]进一步的，所述的步骤C中，稳固装置长90mm，宽45mm，高20mm；中间有长宽尺寸与芯片尺寸相适应的凹槽，凹槽短边一侧开有半圆形切口，方便芯片的放入和取出。
[0020]现有铺入方式得到的芯片，微球是采用接触式的方式铺入芯片，而离心的铺入方式是种非接触式的方式，可以更好的规避由于接触造成的微球表面物理损伤。而且离心的铺入方式可以更好的保存微球表面的修饰基团，并且由于离心力的作用可以使微球入孔更深，更利于后期的实验操作。
[0021]本专利技术中采用硅板固定装置的上板和下板可以有效地将铺入时的微球溶液密封起来，溶液不会蒸发，可以有效的保障整个体系的溶液浓度，并且由于下板的凹槽设计，可以在铺入完成之后回收微球再次利用，极大程度上减少单次微球铺入耗费的用量。整体硅板固定装置(上板和下板用螺钉锁紧后)放入96孔板离心机进行离心铺入时，也能够更好的固定，保证每次铺入操作的一致性。采用稳固装置进行微球稳定离心操作时，可以很好的避免芯片在离心过程中的脱落或者移位，保证每次稳固操作的一致性。
[0022]进一步的，所述的步骤B中，二氧化硅微球溶液为浓度10
‑
100mg/ml的二氧化硅微球乙醇溶液。优选浓度50mg/ml。
[0023]进一步的，所述的步骤B中，二氧化硅微球溶液用量800
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1000ul。优选用量800ul。
[0024]进一步的，所述的步骤B中，二氧化硅微球为共价结合寡核苷酸链的二氧化硅微球。其制备方法包括以下步骤a
‑
c：
[0025]a.二氧化硅微球表面修饰氨基
[0026]原材料为表面带硅羟基的实心二氧化硅微球，将其配制成100mg/mL的乙醇悬浮液。加入能使其表面氨基化的硅烷化试剂，如3
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氨丙基三甲氧基硅烷、3
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氨丙基三乙氧基硅烷等，硅烷化试剂在在混合液中的浓度为0.1％～2.5％。将混合液在室温下摇晃1小时，充分反应完成后，微球表面会带上氨基。
[0027]b.激活二氧化硅微球
[0028]将表面带氨基的微球悬浮在乙腈中，微球的质量浓度为100mg/mL。加入适量二异丙基乙胺和三聚氰氯，混合液中二异丙基乙胺浓度为0.3M，三聚氰氯浓度为0.1M，将混合液在室温下摇晃1小时，三聚氰氯与微球表面的氨基发生缩合反应，使微珠表面基团活性大大增强。用乙腈清洗3～5次去除多余反应物和产物后，再用0.05M～2M的硼酸钠缓冲液冲洗3～5次，最后让微球悬浮在硼酸钠缓冲液中，加入适量盐酸将悬浮液的pH值调整至7.5～
8.5。
[0029]c.二氧化硅微球共价连接寡核苷酸链
[0030]将100nmol待连接的寡核苷酸链干粉用2M的氯化钠溶液溶解，将其与适量硼酸钠微球悬浮液混合，其中微球含量为10～100mg，将混合液在室温下震荡5～8小时，使寡核苷酸链与微球充分接触，并与微球表面的活性基团发生反应。连接反应完成后，将混合液进行1000～3000rpm离心处理，保留上清液。微球用超纯水清洗3～5次，去除多余的反应物和产物，烘干成干粉形式，储存待用。
[0031]本专利技术的第二方面，提供一种如上所述的制备方法制备得到的微珠芯片。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微珠芯片离心制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A、蚀刻：将光刻胶均匀旋涂到单晶硅板表面致使形成一层均匀的薄膜，利用光刻机将掩膜板上的图案转移到光刻胶上，在光刻胶镂空的部分用等离子蚀刻技术在硅板表面蚀刻出密集排列的直径与二氧化硅微球近似的小孔；B、离心装载：使用硅板固定装置固定二氧化硅微球溶液和空白硅板，所述的硅板固定装置包括用于夹紧固定硅板的上板和下板，下板上表面设有与硅板大小相对应的凹槽；将二氧化硅微球溶液加入凹槽内，将空白硅板样本位向下扣在下板凹槽上方，将上板和下板固定锁紧；然后将硅板固定装置固定在96孔板离心机中，在8000
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10000xg离心力下离心10
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15min；离心后将硅板取出，并用大量去离子水清洗硅板表面3次；完成二氧化硅微球的装载；C、离心稳固：将已装载二氧化硅微球的硅板放入稳固装置的凹槽中，样本位向上；然后将稳固装置固定在96孔板离心机中，在5000
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10000xg离心力下离心5
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10min；离心后将硅板取出，并用大量去离子水清洗硅板表面3次。2.根据权利要求1所述的微珠芯片离心制备方法，其特征在于，所述的步骤A中，小孔的深度为1um～2um。3.根据权利要求1所述的微珠芯片离心制备方法，其特征在于，所述的步骤B中，硅板固定装置的下板长90mm，宽45mm，高10mm；下板上表面的凹槽长70mm，宽20mm，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘超钧，王若聆，许心意，
申请(专利权)人：苏州拉索生物芯片科技有限公司，
类型：发明
国别省市：