一种LC-MS/MS测定庆大霉素浓度的方法技术

本发明专利技术涉及医药检测技术领域，具体涉及一种LC

【技术实现步骤摘要】
一种LC
‑
MS/MS测定庆大霉素浓度的方法


[0001]本专利技术属于医药检测
，具体涉及一种LC
‑
MS/MS测定庆大霉素浓度的方法，以及适用的生物样品分析的前处理方法。

技术介绍

[0002]庆大霉素(Gentamicin,GM)，CAS：1403
‑
66
‑
3，分子式C
19
‑
21
H
39
‑
41
N5O7，主要由庆大霉素C1、庆大霉素C1a、庆大霉素C2、庆大霉素C2a组成。分子量分别为477.6(C1)，449.5(C1a)，463.6(C2和C2a)。是由小单孢子属产生的多组分氨基糖苷类抗生素，结构中含有氨基环醇环与氨基糖。这四个组分因结构不同而造成药物疗效和毒理也存在差异：C1组分毒理副作用较小，也不容易产生抗药性，在药物疗效上次于C2组分和C1a组分；C2组分和C1a组分虽治疗效果好但副作用和毒性大，且容易产生抗药性，庆大霉素结构式：
[0003][0004]庆大霉素残留检测方法主要有微生物学法和高效液相色谱法。目前国内关于庆大霉素残留的检测方法主要为微生物法(GB/T21329
‑
2007)，国外大部分采用柱前衍生或柱后衍生荧光检测的方法。美国FSIS推荐的猪可食性组织中庆大霉素残留检测的高效液相色谱
‑
柱后衍生法，组织中庆大霉素用硫酸提取，IRC
‑
50氨基固相柱萃取，液
‑r/>液分配净化，柱后衍生，高效液相色谱荧光检测器测定，Ex为335nm，Em为418nm，OPT(o
‑
phthalaldehyde)为衍生试剂，方法的最低检出限为400μg/kg。
[0005]中国专利文献CN201610540113.X，公开了一种利用9
‑
芴甲基氯甲酸酯为衍生试剂与含氨基的庆大霉素药物通过柱前衍生化，然后通过高效液相色谱
‑
荧光方法检测，测定待测动物制品中标识化合物庆大霉素残留量的方法。该方法包括步骤：标准品制备，生物样品的提取，净化，衍生化反应，液相色谱检测并制标准曲线，生物样品中庆大霉素的检测。该方法采用磷酸盐
‑
三氟乙酸进行提取，9
‑
芴甲基氯甲酸酯进行衍生反应，提取后使用液相色谱荧光方法进行分析，可以定量测定血浆或牛奶中庆大霉素的含量，但是，利用该检测方法对样品中庆大霉素的浓度进行检测时，因庆大霉素具有较高的水溶性和质子化倾向，易与组织成分结合或被玻璃器皿吸附，样品处理的回收率低；异构体较多，色谱分离过程复杂，分离条件不易控制；分子结构缺少发色基团，但活性基团众多，衍生条件的通用性差，使其理化测定方法相当复杂，灵敏度较差。因此，亟需开发出一种能同时提取并净化猪、牛、羊肌肉
和组织中庆大霉素的前处理方法及相应的高效液相色谱检测技术，以期为庆大霉素在猪、牛、羊组织中最高残留限量提供快速、准确、经济的检测方法。

技术实现思路

[0006]为此，本专利技术所要解决的技术问题在于现有技术中的浓度检测方法采用的样品的前处理方法复杂，检测方法的定量限较高、灵敏度较低，无法准确测定血浆样品中低含量的庆大霉素的浓度，进而提供一种庆大霉素的样品的前处理方法，尤其适用于LC
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MS/MS测定庆大霉素的方法。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种LC
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MS/MS测定庆大霉素浓度的方法，包括如下步骤：
[0008](a)制备待测血浆样品的待测样液和庆大霉素标准样品的标准溶液；
[0009](b)采用高液相色谱
‑
三重四级杆质谱联用仪对所述标准溶液进行庆大霉素检测，对庆大霉素和内标物的峰面积进行采集并处理，对庆大霉素和内标物的峰面积的比值与庆大霉素的浓度进行线性回归产生标准曲线和拟合方程；
[0010](c)采用高液相色谱
‑
三重四级杆质谱联用仪对所述待测样液进行庆大霉素检测，得到庆大霉素与内标物的峰面积的比值，将比值代入标准曲线拟合方程，计算得到待测样液中庆大霉素的浓度；
[0011]所述高效液相色谱的检测条件为：
[0012]色谱柱：Agilent Poroshell EC
‑
C8(3.0x100 mm，2.7μm)，
[0013]流速：0.4ml/min，
[0014]柱温：35℃，
[0015]进样体积：10μl；
[0016]所述三重四级杆质谱的检测条件为：
[0017]质量分析器：Waters Xevo TQ
‑
S；离子源：电喷雾离子源；扫描模式：多离子反应监测方式；源温度：500℃；离子化电压(IS)：5500V；气帘气(CUR)：25psi；喷雾气(GS1)：50psi；辅助加热气(GS2)： 50psi。
[0018]优选的，所述待测样液的制备步骤如下：
[0019]提取：向样品中加入提取液，超声提取，离心，收集上层液得上清液；
[0020]净化：采用PCX阳离子交换柱以氨化甲醇为洗脱剂对上清液进行洗脱，收集洗脱液，干燥，用复溶液复溶干燥物，过滤，得到待测样液；
[0021]所述提取液为含磷酸二氢钾、三氯乙酸和乙二胺四乙酸二钠的水溶液；所述复溶液为含醋酸和七氟丁酸酐的水溶液。
[0022]优选的，所述提取液为含0.12
‑
0.15wt％磷酸二氢钾、1
‑
3wt％三氯乙酸和0.01
‑
0.02wt％的乙二胺四乙酸二钠的水溶液；和/或，所述复溶液中含0.2
‑
0.4vt％醋酸和0.8
‑
1.2vt％七氟丁酸酐的水溶液。
[0023]优选的，以10
‑
20vt％的氨化甲醇为洗脱剂；和/或，洗脱之前先采用水和甲醇进行淋洗；和/或，所述PCX阳离子交换柱预先采用甲醇和水进行活化。
[0024]优选的，所述样品的质量与提取液的体积之比为1
‑
3g：6
‑
15mL；和/或，所述样品的质量与复溶液的体积之比为1
‑
3g：0.5
‑
2mL。
[0025]优选的，所述过滤步骤采用PES膜；和/或，样品为肌肉、肾脏、肝脏和脂肪组织中的至少一种。
[0026]优选的，所述高效液相色谱的检测条件包括，以含2mM乙酸铵的0.1vt％的甲酸水溶液为流动相A，以0.1％甲酸乙腈溶液为流动相 B，流动相梯度洗脱程序为：
[0027]时间(min)A(％)B(％)0.090.010.01.090.010.04.070.030.04.15.095.05.05.095.05.190.010.08.090.010.0
[0028]优选的，所述三重四级杆质谱的检测条件还包括：选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种LC
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MS/MS测定庆大霉素浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)制备待测血浆样品的待测样液和庆大霉素标准样品的标准溶液；(b)采用高液相色谱
‑
三重四级杆质谱联用仪对所述标准溶液进行庆大霉素检测，对庆大霉素和内标物的峰面积进行采集并处理，对庆大霉素和内标物的峰面积的比值与庆大霉素的浓度进行线性回归产生标准曲线和拟合方程；(c)采用高液相色谱
‑
三重四级杆质谱联用仪对所述待测样液进行庆大霉素检测，得到庆大霉素与内标物的峰面积的比值，将比值代入标准曲线拟合方程，计算得到待测样液中庆大霉素的浓度；所述高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：Agilent Poroshell EC
‑
C8(3.0x100 mm，2.7μm)，流速：0.4ml/min，柱温：35℃，进样体积：10μl；所述三重四级杆质谱的检测条件为：质量分析器：Waters Xevo TQ
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S；离子源：电喷雾离子源；扫描模式：多离子反应监测方式；源温度：500℃；离子化电压(IS)：5500V；气帘气(CUR)：25psi；喷雾气(GS1)：50psi；辅助加热气(GS2)：50psi。2.根据权利要求1所述的一种LC
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MS/MS测定庆大霉素浓度的方法，其特征在于，所述待测样液的制备步骤如下：提取：向样品中加入提取液，超声提取，离心，收集上层液得上清液；净化：采用PCX阳离子交换柱以氨化甲醇为洗脱剂对上清液进行洗脱，收集洗脱液，干燥，用复溶液复溶干燥物，过滤，得到待测样液；所述提取液为含磷酸二氢钾、三氯乙酸和乙二胺四乙酸二钠的水溶液；所述复溶液为含醋酸和七氟丁酸酐的水溶液。3.根据权利要求2所述的一种LC
‑
MS/MS测定庆大霉素浓度的方法，其特征在于，所述提取液为含0.12
‑
0.15wt％磷酸二氢钾、1
‑
3wt％三氯乙酸和0.01<...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭李珉，陈殿生，周岩，田俊岭，瞿红颖，贾兴，耿智霞，刘静，宋婷婷，刘欣，魏占勇，
申请(专利权)人：河北远征禾木药业有限公司，
类型：发明
国别省市：