修饰的干细胞及其使用方法技术

本发明专利技术提供了修饰的干细胞(SC)和SC治疗疾病的用途。疾病的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰的干细胞及其使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求根据35 U.S.C.
§
119(e)于2019年10月10日提交的美国临时专利申请序列号62/913,568的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文。
[0003]政府支持声明
[0004]本专利技术是根据美国国立卫生研究院授予的R21 AI132910在政府支持下进行的。政府对本专利技术享有一定的权利。


[0005]本专利技术总体上涉及医学领域，并且更具体地涉及基因修饰的(genetically modified)干细胞(SC)如基因修饰的人胚胎干细胞(hESC)以及它们治疗疾病的用途。

技术介绍

[0006]细胞移植形式的再生医学是治疗顽固性医学状况诸如糖尿病、心脏病和神经退行性疾病的的最有前途的疗法之一。然而，在临床上实施细胞移植的主要障碍是供体细胞的免疫排斥，特别是当这些源自外源宿主时。虽然通过施用免疫抑制剂药物来部分解决免疫排斥是可能的，但这些通常带来严重的不良副作用。
[0007]器官移植为治疗患有某些疾病的人提供了机会，并且可以让器官受体过上完整的生活。例如，对于终末期肝病、肺病和心脏病，移植总体上是唯一可用的治疗选择。在免疫抑制药物和辅助护理方面取得了进步，从而提高了患者和移植物的短期存活率。然而，这种成功受到几个问题的阻碍，如移植物长期存活率低、需要持续的免疫抑制药物、以及器官供需之间的差异。
[0008]已经开发了同种异体移植以增加供体组织的供应。然而，限制同种异体应答是主要挑战。除非受体的免疫系统被下调，否则同种异体移植不会成功。现行临床标准是使用全身性免疫抑制药物，这降低了移植物的功效并且大大增加感染的风险。
[0009]在了解免疫监视以及基因修饰细胞(如SCs)的能力方面的进展，使得能够产生避免免疫排斥的细胞。然而，仍然需要开发用于细胞移植疗法的改进技术。

技术实现思路

[0010]本专利技术提供了基因修饰的SC、以及其产生方法和治疗疾病如1型糖尿病(T1D)的用途。
[0011]因此，在实施方式中，本专利技术提供了产生基因修饰的SC的方法。在一个方面，方法包括：a)修饰SC，以相对于野生型SC的HLA
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I、HLA
‑
II或其组合减少表达；和b)引入外源构建体，以表达包括CR1和/或CD24以及任选地CD47、CD55、CD46、CD59和/或HLA
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E
‑
单链三聚体中的一种或多种的免疫逃避基因(immune evasion gene)。
[0012]在一些方面，免疫逃避基因包括CR1和CD24以及任选地CD47、CD55、CD46、CD59和/或HLA
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E
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单链三聚体中一种或多种。
[0013]在一些方面，SC可以被进一步修饰，以表达PDL1和/或HLA
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G
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单链三聚体中的一种或多种。
[0014]在一些方面，免疫逃避基因包括CR1、CD24、CD47、CD55、CD46、CD59和HLA
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E
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单链三聚体。
[0015]在另一实施方式中，本专利技术提供了由本专利技术的方法产生的基因修饰的SC。
[0016]在又一实施方式中，本专利技术提供了修饰的SC，其中：(i)HLA
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I和HLA
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II的表达被消除；并且(ii)SC被基因修饰，以表达CR1和/或CD24以及任选地CD47、CD55、CD46、CD59和/或HLA
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E
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单链三聚体中一个或多个。
[0017]在再一实施方式中，本专利技术提供了源自本专利技术的基因修饰SC的细胞系。
[0018]在另一实施方式中，本专利技术提供了通过分化本专利技术的基因修饰的SC而产生的分化细胞或组织。在各个方面，细胞或组织是小胶质细胞、视网膜色素上皮细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、肝细胞、足细胞、角质形成细胞、心肌细胞、多巴胺能神经元、皮层神经元、感觉神经元、NGN2导向的神经元、中间神经元、基底前脑胆碱能神经元、胰腺β细胞、神经干细胞、自然杀伤细胞、调节T细胞、肺细胞谱系、肾细胞谱系或血细胞谱系。
[0019]在另一实施方式中，本专利技术提供了通过分化本专利技术的基因修饰的SC而产生的β细胞。
[0020]在又一实施方式中，本专利技术提供了用本专利技术的基因修饰的SC、或基因修饰的SC的后代治疗需要其的受试者的疾病或障碍的方法。
[0021]在另一实施方式中，本专利技术提供了治疗受试者中的T1D的方法，方法通过将本专利技术的基因修饰的SC或β细胞施用于受试者，从而治疗受试者中的T1D。
附图说明
[0022]图1A描述了HLA缺陷型hES细胞系的产生。显示的是基因组编辑工作流程。Cas9和三个靶向HLA表达所必需基因的gRNA被核转染到H1 hES细胞中。两轮亚克隆和MiSeq
TM
分析产生克隆突变细胞系。
[0023]图1B描绘了HLA缺陷型hES细胞系的产生。显示的是目标基因的MiSeq
TM
分析的实例。在6个等位基因中的5个中引入了移码突变。
[0024]图1C描绘了HLA缺陷型hES细胞系的产生。显示了WT或HLA
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KO hES细胞的图形数据，有或没有IFNg处理的情况下这些细胞被针对HLA
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I表达染色。在b2m和TAP1缺陷型细胞中不存在HLA
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I表达。
[0025]图2A示例了显示脐带血人源化小鼠不排斥异种畸胎瘤的数据。显示的是代表移植脐带血CD34+细胞20周后NSG
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W41小鼠的脾嵌合体的数据。
[0026]图2B示例了显示脐带血人源化小鼠不排斥异种畸胎瘤的数据。图形数据显示了移植未修饰的或HM
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KO hES细胞后，人源化或对照NSG
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41受体中畸胎瘤的生长。
[0027]图3是图解示例，显示表达免疫逃避基因允许免疫活性小鼠中畸胎瘤生长。用列出的小鼠免疫逃避基因慢病毒转导HLAI/IIKO hES细胞。大约30％的细胞被任何给定的慢病毒感染，导致细胞表达所有4个基因的相对低频率。将这些或对照细胞大量移植到5只WT C57B16/N小鼠中，并且在8周内测量了畸胎瘤的生长。只有接受慢病毒的细胞表现出生长。
[0028]图4是一系列与表达免疫逃避基因的HM
‑
KO细胞选择相关的图表。首先用编码
Crry、mCD55、mCD59、和K
b
单链三聚体的慢病毒转导了HM
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KO细胞。接下来对细胞进行分类，使得它们一致地表达Crry、mCD59、和K
b
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单链三聚体。大约60％的这些细胞也表达mCD55。这些细胞被用于产生用于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.产生干细胞(SC)的方法，包括：a)修饰SC，以相对于野生型SC的HLA
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I、HLA
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II或其组合减少表达；和b)引入外源构建体，以表达包括CR1和/或CD24以及任选地CD47、CD55、CD46、CD59和HLA
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E
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单链三聚体中的一种或多种的免疫逃避基因。2.权利要求1所述的方法，其中所述免疫逃避基因包括CR1和CD24。3.权利要求1所述的方法，其中所述免疫逃避基因包括CR1、CD24以及CD46、CD47、CD55、CD59和HLA
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E
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单链三聚体中的一种或多种。4.权利要求1所述的方法，其中所述免疫逃避基因包括CR1、CD24、CD47、CD55、CD46、CD59和任选地HLA
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E
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单链三聚体。5.权利要求1至4中任一项所述的方法，进一步包括引入外源构建体以表达PDL1和HLA
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G
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单链三聚体中的一种或多种。6.权利要求1所述的方法，其中HLA
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I的表达通过消除TAP1或β2M的表达而降低。7.权利要求1所述的方法，其中HLA
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II的表达通过消除CD74和CIITA的表达而降低。8.权利要求1所述的方法，其中修饰包括使用CRISPR/Cas9靶向突变的基因组编辑。9.权利要求1的方法，其中引入外源构建体是通过慢病毒转导进行的。10.权利要求1所述的方法，其中引入外源构建体是使用腺相关病毒(AAV)构建体进行的。11.权利要求10所述的方法，其中所述AAV构建体是修饰的AAVS构建体，所述AAV构建体靶向位于PPPR12C的内含子区域中的内源性AAV整合位点。12.权利要求1至11中任一项所述的方法，进一步包括将所述SC分化为β细胞。13.通过权利要求1至11中任一项所述的方法产生的干细胞(SC)。14.权利要求13所述的SC，其中：(i)HLA
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I和HLA
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II的表达被消除；和(ii)所述SC表达CR1和/或CD24以及任选地CD47、CD55、CD46、CD59和HLA
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E
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单链三聚体中的一种或多种。15.权利要求14所述的SC，其中所述SC进一步表达PDL1和HLA
‑
G...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：亚利桑那大学董事会，
类型：发明
国别省市：