人工抗原特异性免疫调控性T(AIRT)细胞制造技术

本文公开的组合物和方法的一些实施方式包括经基因编辑的人工免疫调控性T细胞(airT细胞)，所述airT细胞包含组成型表达的FoxP3基因产物和经转导的(例如通过基因编辑、病毒载体转导、转染或其它基因工程方法人工工程化的)T细胞受体(TCR)，所述FoxP3基因产物的表达水平等于或高于天然的调控性T(Treg或抑制性T)细胞中的FoxP3表达水平。在一些实施方式中，所述TCR优选地对与自身免疫性、过敏性或其它炎性病症相关的抗原而言是特异性的。一些实施方式包括airT细胞的制备方法和/或用途。一些此类实施方式包括airT细胞用于治疗和/或改善在其中抗原特异性免疫抑制可能是有益的紊乱(例如自身免疫性、过敏性或其它炎性紊乱)的用途。途。途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人工抗原特异性免疫调控性T(AIRT)细胞
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年3月10日提交的名称为“ARTIFICIAL ANTIGEN
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SPECIFIC IMMUNOREGULATORY T(AIRT)CELLS”的美国临时专利申请第62/987,810号以及2019年6月27日提交的名称为“ANTIGEN
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SPECIFIC TREG THERAPY FOR AUTOIMMUNE DISEASE”的美国临时专利申请第62/867670号的优先权，各自以引用的方式将其整体明确地并入。
[0003]关于美国联邦资助研发的声明
[0004]本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的合同号U01AI101981以及国防部授予的合同号W81XWH
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15
‑1‑
0003的政府支持下完成的。美国政府对本专利技术享有一定的权利。
[0005]序列表的引用
[0006]本申请与电子格式的序列表一起提交。将序列表作为2020年6月23日创建的名称为SCRI252WOSEQLIST的文件提供，其大小为约550Kb。序列表的电子格式内的信息以引用的方式整体并入本文。


[0007]本文提供的一些实施方式包括人工抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞。airT细胞包含人工工程化的免疫系统T淋巴细胞，所述免疫系统T淋巴细胞通过基因编辑被稳定地重编程以表现出某些调控性T细胞(Treg)的特性，并且还通过基因编辑、病毒载体转导、转染或其它基因工程方法进行人工工程化以表达期望的功能性T细胞抗原受体(TCR)或其它抗原受体(例如嵌合抗原受体(CAR))。在一些实施方式中，所述airT细胞能够具有免疫抑制活性，通过TCR响应于特异性抗原识别。

技术介绍

[0008]自身免疫性疾病(例如1型糖尿病、多发性硬化症、心肌炎、类风湿性关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SLE，或“狼疮”))为慢性的、通常危及生命的病症，所述病症由免疫自我耐受性的改变导致，引发异常的免疫活性和终末器官病变。免疫耐受性的不适当和有害的失调也可不期望地导致与过敏、哮喘、移植排斥和/或移植物抗宿主病(GVHD)相关的病变。被称为调控性T细胞(Treg，也称为抑制性T细胞)的特化的抗原识别性源自胸腺的T淋巴细胞在维持免疫耐受性和阻止自身免疫中的作用已得到公认，并且多种自身免疫性病症的特征在于功能失调或调控失调的Treg区室(compartments)。
[0009]作为自身免疫性疾病的潜在疗法，已经在小鼠模型和早期临床试验中探索了根据其免疫抑制能力选择的功能性Treg向患病受试者的过继性转移。然而，此类Treg细胞缺乏自身抗原特异性、以及导致免疫抑制Treg活性丧失的不受控制的细胞可塑性(例如从免疫力的免疫抑制性负调控物向促炎效应样表型的转化)包括对此类Treg过继性转移的有效和持续的治疗益处的两种主要的限制。据信，与多特异性Treg的简单转移相比，使用被选择以抗原特异性地对疾病相关自身抗原进行应答的免疫抑制Treg将带来更安全、更有效的过继性转移策略。在此方面，在输注入受试者后，预期所述自身抗原特异性Treg细胞将特异性地
归巢至自身免疫活性明显的组织部位，并且重要的是，将特异性地介导免疫抑制以响应于驱动自身免疫性疾病发病机制的所述自身抗原。支持此构思的是，小鼠中的研究已表明在自身免疫性疾病的鼠模型中，抗原特异性Treg比多克隆Treg更有效(Duggleby等，2018 Front.Immunol.9:252；Tang等，2004 J Exp Med.199(11):1455
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1465；Tarbell等，2004 J Exp Med 199:1467
‑
1477.)。
[0010]然而，过继性转移的抗原特异性Treg或甚至多克隆Treg用来治疗自身免疫性疾病的治疗应用受到如下限制，尤其是在从天然来源(例如血液和淋巴)分离足够数量的罕见的抗原特异性Treg细胞的过程中遇到的困难，以及外周血中的天然Treg的总体稀缺性(例如大约1％
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4％的外周血单核细胞包含天然Treg)。Treg过继性转移疗法的发展也受到与如下相关的挑战的阻碍：离体扩大Treg群体至治疗数量并同时保持其免疫抑制功能，过继性转移的Treg细胞在过继性宿主中持续存在并在重新输注后增殖的能力较差。在体内炎性环境中Treg可塑性也存在问题，例如从免疫力的免疫抑制负调控物向促炎效应子样表型的转化(Singer等，2014Front.Immunol.5:Art.46；Trzonkowski等，2015 Sci.Translat.Med.7(304):ps18 Romano等，2016 Transplant.Internatl.30:745，McGovern等，2017 Front.Immunol.8:Art.1517)。
[0011]没有在先的方法提供具有期望的抗原特异性的抑制活性的大的稳定的Treg细胞群，例如对参与其中抗原特异性免疫抑制有益的病症(例如自身免疫性疾病、过敏和/或其它炎症)的发病机制的抗原的特异性。
[0012]因此，仍然需要稳定的、抗原特异性的免疫调控细胞，所述细胞在体外和体内保持抗原特异性的免疫抑制能力而不表现出可塑性，因为可以通过过继性转移免疫疗法而有用地给予至需要抗原特异性免疫抑制的受试者。本文提供的实施方式解决了这种需要，并提供了其它相关的优点。

技术实现思路

[0013]本文所提供的方法和组合物的一些实施方式包括人工CD4+CD25+抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞，所述airT细胞包含：(a)叉头框蛋白3/翼状螺旋转录因子(FOXP3)基因的人工修饰，其中，经修饰的基因组成型地表达FOXP3基因产物，所述FOXP3基因产物的FOXP3表达水平等于或高于天然存在的调控性T(Treg)细胞的FOXP3表达水平；以及(b)至少一个经转导的多核苷酸，所述经转导的多核苷酸编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽。
[0014]在一些实施方式中，提供了人工CD4+CD25+抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞，所述airT细胞通过CD4+CD25
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T细胞中的叉头框蛋白3/翼状螺旋转录因子(FOXP3)基因的人工修饰以及至少一个经转导的多核苷酸而获得，其中，所述人工修饰使得airT细胞组成型地表达FOXP3基因产物，所述FOXP3基因产物的FOXP3表达水平等于或高于天然存在的调控性T(Treg)细胞的FOXP3表达水平；所述经转导的多核苷酸编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽。
[0015]在一些实施方式中，所述FOXP3基因存在于包含内含子调控性T细胞(Treg)特异性去甲基化区域(TSDR)的FOXP3基因座中，所述TSDR具有多个胞嘧啶
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鸟嘌呤(CG)二核苷酸，其中，每个CG二核苷酸包含甲基化胞嘧啶(C)核苷酸，所述甲基化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种人工CD4+CD25+抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞，所述细胞包含：(a)叉头框蛋白3/翼状螺旋转录因子(FOXP3)基因的人工修饰，其中，经修饰的所述基因组成型地表达FOXP3基因产物，所述FOXP3基因产物的FOXP3表达水平等于或高于天然存在的调控性T(Treg)细胞的FOXP3表达水平；以及(b)至少一个经转导的多核苷酸，所述经转导的多核苷酸编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽。2.一种人工CD4+CD25+抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞，所述细胞通过CD4+CD25
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T细胞中的叉头框蛋白3/翼状螺旋转录因子(FOXP3)基因的人工修饰以及至少一个经转导的多核苷酸而获得，其中，所述人工修饰使得airT细胞组成型地表达FOXP3基因产物，所述FOXP3基因产物的FOXP3表达水平等于或高于天然存在的调控性T(Treg)细胞的FOXP3表达水平；所述经转导的多核苷酸编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽。3.如权利要求1或2所述的airT细胞，其中，所述FOXP3基因存在于包含内含子调控性T细胞(Treg)特异性去甲基化区域(TSDR)的FOXP3基因座中，所述TSDR具有多个胞嘧啶
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鸟嘌呤(CG)二核苷酸，其中，每个CG二核苷酸包含甲基化胞嘧啶(C)核苷酸，所述甲基化胞嘧啶(C)核苷酸位于包含天然存在的Treg细胞中的去甲基化C核苷酸的核苷酸位置处。4.如权利要求3所述的airT细胞，其中，位于包含天然存在的Treg细胞中的去甲基化C核苷酸的核苷酸位置处的TSDR C核苷酸的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％被甲基化。5.如权利要求1
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4中任一项所述的airT细胞，其中，所述FOXP3基因产物以足以使所述airT细胞在体外维持CD4+CD25+表型至少21天的水平表达。6.如权利要求1
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5中任一项所述的airT细胞，其中，所述FOXP3基因产物以足以使所述airT细胞在过继性转移至需要抗原特异性免疫抑制的免疫相容性哺乳动物宿主后在体内维持CD4+CD25+表型至少60天的水平表达。7.如权利要求1
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6中任一项所述的airT细胞，其中，所述细胞包含选自以下的一种或多种中的表型：(i)HeliosLo、(ii)CD152+、(iii)CD127
ˉ
和(iv)ICOS+。8.如权利要求1
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7中任一项所述的airT细胞，其中，所述人工修饰包括所述细胞中的天然FOXP3基因座的敲除。9.如权利要求1
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8中任一项所述的airT细胞，其中，所述人工修饰包含插入的核酸分子，所述插入的核酸分子包含位于所述细胞的天然FOXP3基因座处的组成型活化的启动子，其中，所述启动子定位于所述FOXP3基因中以能够促进FOXP3基因座的内源的编码FOXP3的核苷酸序列的转录。10.如权利要求9所述的airT细胞，其中，所述插入的核酸分子进一步包含编码第一化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第一CISC组分能够与CISC诱导物分子特异性结合。11.如权利要求10所述的airT细胞，其中，编码所述TCR多肽的所述经转导的多核苷酸进一步包含编码第二化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第二CISC组分不同于所述第一CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。12.如权利要求11所述的airT细胞，其中，编码所述第一CISC组分的所述核酸序列和编码所述第二CISC组分的所述核酸序列进一步包含编码第三CISC组分的核酸序列，所述第三
CISC组分不同于所述第一CISC组分和所述第二CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。13.如权利要求9
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12中任一项所述的airT细胞，其中，包含所述组成型活化的启动子的所述核酸分子被插入至所述天然FOXP3基因座中的内含子调控性T细胞(Treg)特异性去甲基化区域(TSDR)的下游。14.如权利要求9
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13中任一项所述的airT细胞，其中，所述组成型活化的启动子为MND启动子。15.如权利要求1
‑
8中任一项所述的airT细胞，其中，所述人工修饰包含插入的核酸分子，所述插入的核酸分子包含与位于所述细胞的天然FOXP3基因座处的组成型活化的启动子可操作地连接的外源的编码FOXP3的多核苷酸。16.如权利要求15所述的airT细胞，其中，包含与所述组成型活化的启动子可操作地连接的所述外源的编码FOXP3的多核苷酸的所述插入的核酸分子进一步包含编码第一化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第一CISC组分能够与CISC诱导物分子特异性结合。17.如权利要求16所述的airT细胞，其中，编码所述TCR多肽的所述经转导的多核苷酸进一步包含编码第二化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第二CISC组分不同于所述第一CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。18.如权利要求17所述的airT细胞，其中，编码所述第一CISC组分的所述核酸序列和编码所述第二CISC组分的所述核酸序列中的至少一种进一步包含编码第三CISC组分的核酸序列，所述第三CISC组分不同于所述第一CISC组分和所述第二CISC组分并且能够与CISC诱导物分子特异性结合。19.如权利要求15
‑
18中任一项所述的airT细胞，其中，包含与所述组成型活化的启动子可操作地连接的所述外源的编码FOXP3的多核苷酸的所述核酸分子被插入至所述天然FOXP3基因座中的内含子调控性T细胞(Treg)特异性去甲基化区域(TSDR)的下游。20.如权利要求15
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19中任一项所述的airT细胞，其中，所述组成型活化的启动子为MND启动子。21.如权利要求1
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8中任一项所述的airT细胞，其中，所述人工修饰包括在除所述细胞的天然FOXP3基因座以外的染色体位点处的核酸分子的插入，所述核酸分子包含与组成型活化的启动子可操作地连接的外源的编码FOXP3的多核苷酸。22.如权利要求21所述的airT细胞，其中，所述airT细胞的至少一个天然T细胞受体(TCR)基因座被敲除或失活，并被编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的所述至少一个经转导的多核苷酸替换。23.如权利要求22所述的airT细胞，其中，被敲除的所述至少一个天然TCR基因座为天然TCRα链(TRAC)基因座。24.如权利要求21
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23中任一项所述的airT细胞，其中，包含与所述组成型活化的启动子可操作地连接的所述外源的编码FOXP3的多核苷酸的所述插入的核酸分子进一步包含编码第一化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第一CISC组分能够与CISC诱导物分子特异性结合。25.如权利要求24所述的airT细胞，其中，编码所述TCR多肽的所述经转导的多核苷酸
进一步包含编码第二化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第二CISC组分不同于所述第一CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。26.如权利要求25所述的airT细胞，其中，编码所述第一CISC组分的所述核酸序列和编码所述第二CISC组分的所述核酸序列中的至少一种进一步包含编码第三CISC组分的核酸序列，所述第三CISC组分不同于所述第一CISC组分和所述第二CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。27.如权利要求21
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26中任一项所述的airT细胞，其中，所述组成型活化的启动子为MND启动子。28.如权利要求21
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27中任一项所述的airT细胞，其中，除天然FOXP3基因座之外的所述染色体位点位于所述细胞的T细胞受体α链(TRAC)基因座内，并且在所述染色体位点处插入包含外源的编码FOXP3的多核苷酸的核酸分子，所述外源的编码FOXP3的多核苷酸与所述组成型活化的启动子可操作地连接。29.如权利要求1
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28中任一项所述的airT细胞，其中，在所述airT细胞中，至少一个天然T细胞受体(TCR)基因座被敲除或失活，并被编码抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的所述至少一个经转导的多核苷酸替换。30.如权利要求29所述的airT细胞，其中，被敲除的所述至少一个天然TCR基因座为天然TCRα链(TRAC)基因座。31.一种人工CD4+CD25+抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞，所述细胞包含：(a)编码外源叉头框蛋白3/翼状螺旋转录因子(FOXP3)基因产物的经转导的核酸序列，其中，所述细胞组成型地表达FOXP3基因产物，所述FOXP3基因产物的FOXP3表达水平等于或高于天然存在的调控性T(Treg)细胞的FOXP3表达水平；以及(b)至少一个经转导的多核苷酸，所述经转导的多核苷酸编码外源抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽；其中，编码所述外源FOXP3基因产物的所述经转导的核酸序列进一步包含编码第一化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第一CISC组分能够与CISC诱导物分子特异性结合；并且其中，编码所述外源TCR基因产物的所述经转导的核酸序列进一步包含编码第二化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第二CISC组分不同于所述第一CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。32.一种人工CD4+CD25+抗原特异性免疫调控性T(airT)细胞，所述细胞包含：(a)已被敲除的天然FOXP3基因座，并通过同源定向修复将FOXP3基因座插入以下的任一项中：(i)包含组成型活化的启动子的核酸分子，所述组成型活化的启动子能够促进FOXP3基因的内源的编码FOXP3的核苷酸序列的转录，或(ii)包含组成型活化的启动子的核酸分子，所述组成型活化的启动子与编码外源FOXP3蛋白或其功能衍生物的核苷酸序列可操作地连接，并且所述核酸分子组成型地表达所述FOXP3基因产物，所述FOXP3基因产物的FOXP3表达水平等于或高于天然存在的调控性T(Treg)细胞的所述FOXP3表达水平，其中，编码所述组成型活化的启动子或编码与编码外源FoxP3蛋白或其功能衍生物的所述核苷酸序列可操作地连接的所述组成型活化的启动子的所述插入的核酸分子进一步包含编码第一化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第一CISC组分能够与CISC诱导物分子特
异性结合；以及(b)已被敲除的天然的T细胞受体α链(TRAC)基因座，并通过同源定向修复将TRAC基因座插入编码外源抗原特异性T细胞受体(TCR)多肽的至少一个经转导的多核苷酸，其中，编码所述外源TCR多肽的所述经转导的核酸序列进一步包含编码第二化学诱导信号复合物(CISC)组分的核酸序列，所述第二CISC组分不同于所述第一CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。33.如权利要求31或32所述的airT细胞，其中，编码所述第一CISC组分的核酸序列和编码所述第二CISC组分的核酸序列中的至少一种进一步包含编码第三CISC组分的核酸序列，所述第三CISC组分不同于所述第一CISC组分和所述第二CISC组分并且能够与所述CISC诱导物分子特异性结合。34.如权利要求1
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33中任一项所述的airT细胞，所述细胞包含各自编码抗原特异性TCR多肽的至少第一经转导的多核苷酸和第二经转导的多核苷酸，其中，所述第一经转导的多核苷酸编码TCR V
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α多肽并且所述第二经转导的多核苷酸编码TCR V
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β多肽，其中，所述V
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α多肽和所述V
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β多肽包含能够特异性识别抗原的功能性TCR。35.如权利要求1
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34中任一项所述的airT细胞，所述细胞表达包含抗原特异性TCR多肽的抗原特异性T细胞受体(TCR)，所述TCR多肽由编码所述TCR多肽的所述至少一个经转导的多核苷酸编码，并且所述TCR能够响应于通过由所述TCR多肽特异性识别的抗原引起的HLA限制性刺激来进行抗原特异性诱导的免疫抑制。36.如权利要求35所述的airT细胞，其中，所述抗原特异性诱导的免疫抑制包括以下中的一种或多种：(i)对效应T细胞的激活和增殖中的任一者或两者的抑制，所述效应T细胞识别由所述airT TCR特异性识别的所述抗原，所述airT TCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的所述TCR多肽，(ii)对效应T细胞的炎性细胞因子或炎性介质的表达的抑制，所述效应T细胞识别由所述airT TCR特异性识别的所述抗原，所述airT TCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的所述TCR多肽，(iii)通过所述airT细胞对一种或多种免疫抑制细胞因子、穿孔素/颗粒酶或抗炎性产物的加工，或在所述airT细胞中诱导吲哚胺2,3
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双加氧酶(IDO)、IL2或腺苷的竞争、色氨酸的分解代谢和抑制性受体的表达中的至少一种，以及(iv)对效应T细胞的激活和增殖中的任一者或两者的抑制，所述效应T细胞不会识别由所述airT TCR特异性识别的所述抗原，所述airT TCR包含由所述至少一个经转导的多核苷酸编码的所述TCR多肽。37.如权利要求1
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36中任一项所述的airT细胞，其中，所述TCR特异性识别与自身免疫性病症、过敏性病症或炎性病症的发病机制相关的抗原。38.如权利要求37所述的airT细胞，其中：(i)所述自身免疫性病症选自1型糖尿病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、克罗恩病、大疱性类天疱疮、寻常型天疱疮、自身免疫性肝炎、牛皮癣、干燥综合征、或乳糜泻；(ii)所述过敏性病症选自过敏性哮喘、花粉过敏、食物过敏、药物过敏或接触性皮炎；以及(iii)所述炎性病症选自胰岛细胞移植、哮喘、肝炎、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、移植物抗宿主病(GVHD)、移植耐受诱导、移植排斥或脓毒症。
39.如权利要求38所述的airT细胞，其中：(i)与所述自身免疫性病症的发病机制相关的所述抗原选自图141
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图144中任一者或多者中列出的自身抗原，(ii)与所述过敏性病症的发病机制相关的所述抗原选自图141
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图144中任一者或多者中列出的过敏性抗原，以及(iii)与所述炎性病症的发病机制相关的所述抗原选自图141
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图144中任一者或多者中列出的炎症相关抗原。40.如权利要求1
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39中任一项所述的airT细胞，所述细胞包含编码TCR多肽的至少一个经转导的多核苷酸序列，所述TCR多肽以人HLA限制性方式特异性地结合至：选自图141
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图144的任一者或多者中列出的所述抗原性多肽序列中的任一项的氨基酸序列或由图139
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图140的任一者或多者中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列的不超过35个、34个、33个、32个、31个、30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个或7个连续氨基酸的抗原性多肽表位。41.如权利要求40所述的airT细胞，所述细胞包含分别编码TCR的TCR V
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α多肽和TCR V
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β多肽的至少第一经转导的多核苷酸序列和第二经转导的多核苷酸序列，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：简，
申请(专利权)人：贝纳罗亚研究院，
类型：发明
国别省市：