一种CIK细胞的诱导培养方法技术

本发明专利技术公开了一种CIK细胞的诱导培养方法，包括以下步骤：(1)自外周血中分离单个核细胞；(2)将单个核细胞用X

【技术实现步骤摘要】
一种CIK细胞的诱导培养方法


[0001]本专利技术涉及免疫细胞领域，尤其涉及一种CIK细胞的诱导培养方法。

技术介绍

[0002]CIK细胞是将人体单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群细胞，又被称为NK细胞样T淋巴细胞，同时具备T细胞和NK细胞样表型特征，兼具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤优点。CIK细胞具有增殖能力强、杀瘤活性强、杀瘤谱广、对正常骨髓造血前体细胞毒性小等特点，广泛用于细胞免疫治疗中。
[0003]CIK细胞有多种杀瘤机制，可以对肿瘤进行直接杀伤，通过Fas/FasL信号通路诱导肿瘤细胞凋亡，CIK活化后产生大量细胞因子的抑制杀瘤作用，激活机体免疫系统，提高机体免疫功能。CIK细胞能够特异地识别肿瘤细胞和受病毒感染的细胞，而不对健康细胞做出反应，CIK细胞在治疗恶性黑色素瘤、胃癌、肾癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等均有应用。
[0004]治疗用CIK细胞通常来源于患者外周血单个核细胞，但是，外周血中杀伤细胞的数量有限，无法满足治疗过程中对于CIK细胞的大量需求，因此需要对CIK细胞进行体外扩增。现有的CIK培养方法需要使用血清，存在着CIK细胞生长缓慢、增殖效果差以及对于肿瘤细胞的细胞毒性弱等问题，另外还存在制备过程比较繁杂的问题，CIK细胞的增殖活性和杀伤力对基于CIK细胞的肿瘤免疫疗法效果至关重要。因此，研究一种能提高CIK细胞体外增殖能力和肿瘤杀伤能力的培养方法十分必要。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种CIK细胞的诱导培养方法，提高了体外诱导培养CIK细胞的效率。
[0006]本专利技术的目的采用如下技术方案实现：
[0007]一种CIK细胞的诱导培养方法，包括以下步骤：
[0008](1)自外周血中分离单个核细胞；
[0009](2)将单个核细胞用X
‑
VIVO 15培养基重悬后进行培养，在培养的第2天向培养基中补加IL
‑
2、IL
‑
18、绿藻生长因子、谷氨酰胺、CD3单抗继续培养，此后每2
‑
3天补液一次至第7天；
[0010](3)自第8天开始每2
‑
3天补液一次，诱导培养至14天；
[0011]步骤(2)中所述补液的培养基为向X
‑
VIVO 15培养基中添加以下成分制备得到：IL
‑
2、IL
‑
18、绿藻生长因子；
[0012]步骤(3)中所述补液的培养基为向X
‑
VIVO 15培养基中添加以下成分制备得到：IL
‑
2、牡荆素、甲巯咪唑。
[0013]进一步地，步骤(2)中在培养第2天补加的IL
‑
2、IL
‑
18、绿藻生长因子、谷氨酰胺、CD3单抗在培养基中的浓度为：IL
‑
2 1000
‑
2000IU/mL、IL
‑
18 100
‑
120ng/mL、绿藻生长因子20
‑
30ng/mL、谷氨酰胺5
‑
10μg/mL、CD3单抗1
‑
5μg/mL。
[0014]进一步地，步骤(2)中所述补液的X
‑
VIVO 15培养基中IL
‑
2、IL
‑
18、绿藻生长因子的浓度为：IL
‑
2 1000
‑
2000IU/mL、IL
‑
18 100
‑
120ng/mL、绿藻生长因子20
‑
30ng/mL。
[0015]进一步地，步骤(3)中所述补液的X
‑
VIVO 15培养基中IL
‑
2、牡荆素、甲巯咪唑的浓度为：IL
‑
2 1000
‑
2000IU/mL、牡荆素2
‑
6μg/mL、甲巯咪唑10
‑
20ng/mL。
[0016]进一步地，步骤(2)中单个核细胞在X
‑
VIVO 15培养基中的接种密度为1.5
‑4×
106个/mL。
[0017]进一步地，步骤(2)和步骤(3)中通过补液细胞密度维持在1.5
‑4×
106个/mL。
[0018]进一步地，细胞培养过程均在37℃，5％CO2的培养箱中进行。
[0019]进一步地，步骤(1)中分离单个核细胞个过程如下：采集外周血，加PBS缓冲液稀释后加入淋巴细胞分离液，离心后弃上清，PBS洗涤后得到单个核细胞。
[0020]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供一种CIK细胞的诱导培养方法，首先在单个核细胞的培养基中添加IL
‑
2、IL
‑
18、绿藻生长因子等成分，然后在培养过程中及时补液，在培养7天后调整补液的培养基中的添加成分，通过添加IL
‑
2、牡荆素、甲巯咪唑更好的促进CIK细胞的增殖，有效提高CIK细胞的增殖效率，并且得到的CIK细胞纯度高，肿瘤杀伤活性好，保障其在免疫疗法中的应用效果。
附图说明
[0021]图1为本专利技术实施例1，对比例1至5培养的CIK细胞中CD3+CD56+细胞占比。
具体实施方式
[0022]下面，结合附图以及具体实施方式，对本专利技术做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
[0023]实施例1
[0024]一种CIK细胞的诱导培养方法，包括以下步骤：
[0025](1)自外周血中分离单个核细胞：采集外周血，加PBS缓冲液按照1:2的体积比稀释后加入Ficoll淋巴细胞分离液，分装在离心管中，离心后弃上清，用PBS洗涤后得到单个核细胞；
[0026](2)将单个核细胞用X
‑
VIVO 15培养基重悬后分装在培养瓶中在37℃，5％CO2的培养箱中培养，细胞接种密度为1.5
×
106个/mL，在培养的第2天向培养基中补加浓度为IL
‑
2 1000IU/mL、IL
‑
18 100ng/mL、绿藻生长因子20ng/mL、谷氨酰胺5μg/mL、CD3单抗1μg/mL继续培养，此后每2天补液一次至第7天，每次补液后细胞密度维持在1.5
×
106个/mL；补液的X
‑
VIVO 15培养基中添加以下成分制备得到：IL
‑
2、IL
‑
18、绿藻生长因子，各成分在补液培养基中的浓度为：IL
‑
2 1000IU/mL、IL
‑
18 100ng/mL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CIK细胞的诱导培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)自外周血中分离单个核细胞；(2)将单个核细胞用X
‑
VIVO 15培养基重悬后进行培养，在培养的第2天向培养基中补加IL
‑
2、IL
‑
18、绿藻生长因子、谷氨酰胺、CD3单抗继续培养，此后每2
‑
3天补液一次至第7天；(3)自第8天开始每2
‑
3天补液一次，诱导培养至14天；步骤(2)中所述补液的培养基为向X
‑
VIVO 15培养基中添加以下成分制备得到：IL
‑
2、IL
‑
18、绿藻生长因子；步骤(3)中所述补液的培养基为向X
‑
VIVO 15培养基中添加以下成分制备得到：IL
‑
2、牡荆素、甲巯咪唑。2.根据权利要求1所述CIK细胞的诱导培养方法，其特征在于，步骤(2)中在培养第2天补加的IL
‑
2、IL
‑
18、绿藻生长因子、谷氨酰胺、CD3单抗在培养基中的浓度为：IL
‑
2 1000
‑
2000IU/mL、IL
‑
18 100
‑
120ng/mL、绿藻生长因子20
‑
30ng/mL、谷氨酰胺5
‑
10μg/mL、CD3单抗1
‑
5μg/mL。3.根据权利要求1所述CIK细胞的诱导培养方法，其特征在于，步骤(2)中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：解静，陈博，
申请(专利权)人：南京思己静科技有限公司，
类型：发明
国别省市：