配合自体血浆使用的具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物及其用途制造技术

本发明专利技术涉及细胞培养领域，公开了一种配合自体血浆使用的具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物及其用途。该组合物含有糖皮质激素、人白介素2、人白介素15、CD335单克隆抗体、CD16单克隆抗体以及相对于每纳克的CD335单克隆抗体含量为10

【技术实现步骤摘要】
配合自体血浆使用的具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物及其用途


[0001]本专利技术涉及细胞体外培养领域，具体涉及一种配合自体血浆使用的具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物及其用途。

技术介绍

[0002]自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)作为机体重要的免疫细胞。在肿瘤免疫治疗，病毒疾病免疫治疗，抗衰老治疗中发挥重要作用。在临床应用中，通过培养外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)获得NK细胞，体外培养可以扩增并纯化NK细胞，使其达到临床应用的数量和纯度要求。
[0003]NK细胞的体外培养方法主要有饲养层细胞共培养法和单纯细胞因子刺激法。其中，单纯细胞因子刺激法是指在不使用饲养层细胞共培养的情况下，加入相应细胞因子，使PBMC中的NK细胞激活并增殖。但是，单纯细胞因子刺激法使用的培养系统中，往往依赖于胎牛血清或者小牛血清。胎牛血清或者小牛血清含有丰富的细胞生长增殖必需的营养成分，如生长因子、激素类物质等，可促进NK细胞存活生长和增殖，并维持NK细胞功能。
[0004]基于胎牛血清或者小牛血清存在上述优点，因此现有的制备临床用犬NK细胞的方法多依赖于胎牛血清或者小牛血清。但是，胎牛血清或者小牛血清的使用还是给制备符合临床要求的犬NK细胞带来了诸多不便。第一，不同批次的胎牛血清或小牛血清其生物活性，激素以及细胞因子存在差异，导致临床制备的犬NK细胞品质不稳定，很难做到标准化生产。第二，胎牛血清或者小牛血清中含有大量异源性蛋白，容易引起接种犬对细胞制品的过敏反应。第三，胎牛血清或者小牛血清中可能存在外源污染的病毒和致病因子带来了临床应用风险。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的使用胎牛血清或者小牛血清自然杀伤细胞品质不稳定不能标准化量产，易引起犬只过敏反应，以及可能带来外源污染的病毒和致病因子的问题，提供一种具有利用自体血浆培养临床用犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物及其体外培养的方法，该组合物及其体外培养的方法使用犬自体血浆替代了胎牛血清或者小牛血清，在无血清培养基中提供细胞生长所必需的物质，使细胞生长增殖。使制备的犬自然杀伤细胞安全且能高效扩增，并避免了异源性蛋白、外源性病毒和其他致病因子导致的致病和污染、不可量产以及易过敏的缺陷，更好的应用于宠物临床细胞治疗。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术第一方面提供一种配合自体血浆使用的具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物，该组合物含有糖皮质激素、人白介素2、人白介素15、CD335单克隆抗体和CD16单克隆抗体，其中，相对于每纳克的CD335单克隆抗体，人白介素2的含量为10
‑
40IU，人白介素15的含量为0.6
‑
2.4ng。
[0007]本专利技术第二方面提供一种利用自体血浆体外培养犬自然杀伤细胞的方法，该方法
包括：将犬的自体血浆分离得到外周血单个核细胞与上述组合物混合进行激活培养。
[0008]通过上述技术方案，本专利技术使用犬自体血浆制备全自然杀伤细胞安全且高效，扩增倍数可达30倍以上，本专利技术的配方可以避免使用胎牛血清或小牛血清对犬只的伤害，达到标准易把控的效果，进一步的应用于宠物的临床治疗减小风险，减少致病因素。
附图说明
[0009]图1是金毛寻回犬NK细胞体外激活过程中不同时间的显微镜照片；
[0010]图2是金毛寻回犬NK细胞体外扩增过程中不同时间的显微镜照片；
[0011]图3是金毛寻回犬NK细胞体外扩增细胞增殖曲线；
[0012]图4是金毛寻回犬NK细胞体外扩增细胞表型变化图；
[0013]图5是拉布拉多寻回犬NK细胞体外激活过程中不同时间的显微镜照片；
[0014]图6是拉布拉多寻回犬NK细胞体外扩增过程中不同时间的显微镜照片；
[0015]图7是拉布拉多寻回犬NK细胞体外扩增细胞增殖曲线；
[0016]图8是拉布拉多寻回犬NK细胞体外扩增细胞表型变化图；
[0017]图9是犬NK细胞体外扩增后纯度鉴定结果图。
具体实施方式
[0018]在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0019]在本专利技术中，在未作相反说明的情况下，使用的“PBMC”通常是指外周血单个核细胞。“NK细胞”是指自然杀伤细胞。“IL
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2”是指人白介素2。“IL
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15”是指人白介素15。KE为消除速率常数，表示单位时间内机体能消除药物的固定分数或百分比。IL
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2的单位IU是通过生物检定的方法，检测0.1ng/mL的IL
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2刺激CTLL
‑
2细胞增殖的最小量，得到具有一定生物效能的最小效价单元为“单位”(u)的国际单位。
[0020]本专利技术第一方面提供一种配合自体血浆使用的具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物，该组合物含有糖皮质激素、人白介素2、人白介素15、CD335单克隆抗体和CD16单克隆抗体，其中，相对于每纳克的CD335单克隆抗体，人白介素2的含量为10
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40IU(如10IU、11IU、12IU、13IU、14IU、15、16IU、18IU、19IU、20IU、26IU、28IU、34IU、36IU、40IU或上述数值之间的任意值)，人白介素15的含量为0.6
‑
2.4ng(如0.6ng、0.61ng、0.62ng、0.63ng、0.64ng、0.65ng、0.66ng、0.7ng、0.75ng、0.8ng、1ng、1.2ng、1.6ng、1.8ng、2.0ng、2.2ng、2.4ng或上述数值之间的任意值)。
[0021]根据本专利技术，相对于每纳克的CD335单克隆抗体，所述糖皮质激素的含量优选为0.06
‑
0.3μg(如0.06μg、0.065μg、0.066μg、0.067μg、0.0068μg、0.069μg、0.07μg、0.071μg、0.072μg、0.073μg、0.074μg、0.075μg、0.076μg、0.08μg、0.085μg、0.09μg、0.1μg、0.15μg、0.2μg、0.25μg、0.3μg或上述数值之间的任意值)，CD16单克隆抗体的含量优选为1
‑
4ng(如1ng、1.1ng、1.2ng、1.3ng、1.4ng、1.5ng、1.8ng、2.0ng、2.5ng、3ng、3.5ng、4ng或上述数值之间的任意值)。
[0022]根据本专利技术一种更优选的实施方式，相对于每纳克的CD335单克隆抗体，所述糖皮质激素的含量为0.07...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种配合自体血浆使用的具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物，其特征在于，该组合物含有糖皮质激素、人白介素2、人白介素15、CD335单克隆抗体和CD16单克隆抗体，其中，相对于每纳克的CD335单克隆抗体，人白介素2的含量为10
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40IU，人白介素15的含量为0.6
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2.4ng。2.根据权利要求1所述的组合物，其中，相对于每纳克的CD335单克隆抗体，所述糖皮质激素的含量为0.06
‑
0.3μg，CD16单克隆抗体的含量为1
‑
4ng；优选地，相对于每纳克的CD335单克隆抗体，所述糖皮质激素的含量为0.07
‑
0.15μg、人白介素2的含量为10
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20IU、人白介素15的含量为0.6
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1.2ng和CD16单克隆抗体的含量为1
‑
2ng。3.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述糖皮质激素为泼尼松、甲泼尼松、倍他米松、丙酸倍氯米松、泼尼松龙、氢化可的松和地塞米松中的至少一种，优选为氢化可的松。4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物中还包括X
‑
VIVO 15培养基、犬自体血浆和灭活的A群链球菌(Streptococcus pyogenes)中的至少一种。5.根据权利要求4所述组合物，其中，所述X
‑
VIVO 15培养基和犬自体血浆的体积比为9
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50：1；和/或，相对于总量为1mL的X
‑
VIVO 15培养基和犬自体血浆，所述CD335单克隆抗体的含量为50
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200ng。6.据权利要求4所述的组合物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵献军，魏强，白春娜，田方杰，马樱琬，张翊华，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：