一种人NKT细胞系及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种人NKT细胞系，命名为NKT细胞系617，其保藏号为：CCTCC NO：C2022121，保藏日期为2022年5月9日。本发明专利技术的NKT细胞系617来源于一位女性NKTCL患者的外周血，此患者EBV感染呈阴性，建立的细胞系EBV鉴定亦呈阴性。该细胞系EBV阴性能长期在体外连续传代培养，目前已在体外培养两年余，单克隆成功，低剂量IL

【技术实现步骤摘要】
2001；51:778
–
785)。它们大多转染EBV以获得永生化细胞株或本身已感染EBV，因此提供一株EBV阴性的永生化细胞株对于各类疾病和筛选诊断分子以及药物具有重要意义和独特价值。
[0007]鉴于此，提供一株EBV阴性的永生化细胞株对于NKTCL和筛选诊断分子以及药物具有重要意义和独特价值。

技术实现思路

[0008]专利技术目的：本针对现有技术的不足，本专利技术提供一种人NKT细胞系，命名为人NKT细胞系617，其来源于NKTCL患者的外周血，患者EBV感染呈阴性，建立的细胞系EBV鉴定亦呈阴性。
[0009]本专利技术的NKT细胞系617来源一位女性NKTCL患者的外周血，患者无明显诱因出现左侧颈部区域淋巴结肿大，后全身多发淋巴结肿大及大量腹水，肝脾肿大，流式细胞学检测示CD4
+
、CD2
+
、CD5
+
、CD38
+
、HLA
‑
DR
+
、CD56
+
、cCD3
+
、mCD3
‑
，TCR重排阳性，结合临床诊断为NKTCL。NKTCL是一种与EB病毒阳性高度相关的淋巴瘤，但此患者EBV感染呈阴性，建立的细胞系EBV鉴定亦呈阴性。
[0010]本专利技术的NKT细胞系617保藏于保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：C2022121，保藏日为2022年5月9日，保藏地址为：中国武汉武汉大学。
[0011]该细胞系EBV阴性能长期在体外连续传代培养，目前已在体外培养两年余，单克隆成功，低剂量IL
‑
2依赖可以大量扩增的人NKT细胞系，为人NKT相关研究及临床过继免疫治疗提供新的工具实验模型。
[0012]此外，NKT细胞不受高度多态性人类白细胞抗原(HLA)的限制，而是受单态性CD1d的限制，因此与传统的自体CAR
‑
T细胞技术相反，CAR
‑
NKT细胞可以实现同种异体，降低了移植物抗宿主病的风险。消除对困扰当前CAR
‑
T细胞疗法的个性化和患者特异性产品需求。目前用于过继性细胞免疫疗法的NKT细胞多为健康供体的原代细胞。相比于原代NKT细胞，成熟且特征明确的同质细胞系基因改造有许多优势：产生“无限”数量的NKT细胞用于CAR治疗；细胞系的一致性导致CAR转导效率更高等。本专利技术提供的NKT细胞系617(下述简称为NKT617)消除了作为同种异体细胞疗法临床使用时，潜在感染EBV的可能。NKT细胞系作为一种新型的抗肿瘤细胞免疫治疗具有巨大的前景。
附图说明
[0013]图1为100
×
下NKT617细胞形态；
[0014]图2为1000
×
下NKT617细胞吉姆萨染色图片结果图；
[0015]图3为NKT617细胞透射电镜结果(加速电压80kV，2500倍放大)；
[0016]图4为NKT617细胞扫描电镜结果(加速电压3kV，13.5mm长度5000倍放大)；
[0017]图5为NKT617细胞对IL
‑
2浓度的增殖依赖性的影响；
[0018]图6为无IL
‑
2条件下，NKT617随时间发生部分自发凋亡的结果图；
[0019]图7为NKT617细胞的增长曲线图；
[0020]图8为NKT617染色体核型图；
[0021]图9为NKT617TCR基因的克隆性重排图；
[0022]图10为NKT617免疫表型分析结果；
[0023]图11为NKT617细胞支原体PCR检测结果图；
[0024]图12为NKT617细胞Hoechst33342染色结果图；
[0025]图13为转染NKT617细胞制备的抗CD
‑
CAR
‑
NKT细胞阳性率检测结果图；
[0026]图14为流式细胞术检测CD
‑
CAR
‑
NKT体外杀伤Ramos细胞结果图。
具体实施方式
[0027]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术做更进一步的具体说明，本专利技术的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
[0028]实施例1 NKT617细胞系的建立和表征。
[0029](1)细胞系的建立
[0030]1.1标本来源：
[0031]取自一名患有NKTCL女性患者的外周血，肝素抗凝。经患者及家属同意，签订知情同意书。该患者无明显诱因出现左侧颈部区域淋巴结肿大，后全身多发淋巴结肿大及大量腹水，肝脾肿大，流式细胞学检测示CD4
+
、CD2
+
、CD5
+
、CD38
+
、HLA
‑
DR
+
、CD56
+
、cCD3
+
、CD3
‑
，TCR重排阳性，结合临床诊断为NKTCL。NKTCL是一种与EB病毒阳性高度相关的淋巴瘤，但此患者EBV感染呈阴性，建立的细胞系EBV鉴定亦呈阴性。
[0032]1.2外周血单个核细胞分离：
[0033]无菌抽取患者外周血2mL，用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，2000rpm，室温20℃，离心20min。吸取中界层面的单个核细胞，经PBS液洗2遍，1500rpm，室温20℃，离心10min，加入新鲜完全的1640培养液，后将2mL细胞悬液分装至24孔培养板内，并添加50
‑
100U的重组人IL
‑
2，在37℃、5％CO2培养箱中进行培养。
[0034]1.3细胞的培养建系
[0035]细胞培养72小时后，镜下观察可见透亮而生长旺盛的淋巴细胞，每间隔2
‑
3天吸掉500μL上清，加入含有重组人IL
‑
2的1640培养液。一周以后，在镜下观察，可见细胞培养板孔内细胞生长特别旺盛，有细胞成团生长现象，周边有许多透亮、圆形、大小不等的淋巴细胞密集生长，有的凝聚成葡萄串样生长。培养二周后，仔细挑选出几个细胞生长特别旺盛的孔，将孔内细胞轻轻吹打后传代至T25细胞瓶中培养，随后细胞生长状况好，且生长速率快，2
‑
3天可以传代一次。间隔2
‑
3天后显微镜观察细胞形态：取细胞培养板置于倒置显微镜下，目镜10
×
，物镜10
×
。图1所示为NKT617细胞形态(100
×
)，细胞呈透亮圆形，生长旺盛。
[0036]该细胞已连续稳定生长2年以上，经液氮冻存后复苏，细胞状态好，存活率达95％以上，将该细胞命名为NKT细胞系617(下文简称为NKT617)。本专利技术的NKT细胞系617保藏于保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：C2022121，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人NKT细胞系，命名为NKT细胞系617，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：C2022121，保藏日为2022年5月9日。2.根据权利要求1所述的人NKT细胞系，其特征在于，所述人NKT617...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱学军，黎陈铖，刘细细，田芳，陈碧清，徐祖琼，姜鹏君，张玮光，杨箐，
申请(专利权)人：江苏省中医院，
类型：发明
国别省市：