落叶松高效再生及离体采穗圃建立方法技术

本发明专利技术属于植物组织培养和快速繁殖技术领域，具体涉及落叶松高效再生及离体采穗圃建立方法。本发明专利技术以落叶松芽点为外植体进行了离体再生研究，诱导了定芽芽点的萌动和伸长，获得了快速伸长植株，进一步高效诱导了定芽芽点产生，为市场提供一种不受季节限制，快捷再生的循环培养方法。该方法可用于建立高效的离体采穗圃体系，单次循环8周，繁殖系数为7，芽苗数量呈几何级数增加，周年生产高活力的复幼枝条。条。

【技术实现步骤摘要】
落叶松高效再生及离体采穗圃建立方法


[0001]本专利技术涉及一种植物组织培养即植物再生和快速繁殖
，具体涉及落叶松高效再生及离体采穗圃建立方法。

技术介绍

[0002]落叶松(Larix)为松科（Pinaceae）的落叶乔木，是松科中唯一属具有落叶特性的乔木，包含18个种，主要分布于北半球温带山区、寒温带的平原及高山气候区，是极地冻土带优势物种，该物种极为耐寒、喜光，是森林更新，荒山造林的重要树种。落叶松成林快、树姿挺拔、适应性强、耐瘠薄，在林业生产和景观应用上倍受重视。其木材耐腐蚀、抗压力、单分子纤维长度长，可用于大型木材的获得，既是优质建筑用材，又是高档打印纸的基础原料。从落叶松中提取的紫杉叶素和阿拉伯半乳聚糖在医药、食品等行业广泛应用。
[0003]当前落叶松的人工林抚育主要通过扦插方式进行，但扦插苗随着采穗母株年龄增长，活力下降，需要定期整干，定期复幼，来保持接穗活力；部分复幼途径经由大树新枝嫁接到幼树砧木达到良种苗复幼效果。上述操作复杂，耗时费力，繁殖系数低，受季节限制。
[0004]落叶松具有高度的杂合性，有性繁殖后代的变异较大，其育种周期长且见效慢，后代性状不能够进行定向改良。由于离体再生具有速度快、周期短、高效、稳定等特点，因此落叶松的遗传改良与无性系繁殖一直受到各国林业决策部门的重视与林木育种工作者以及森林经营者的特别关注（吴丽君. 针叶树离体培养研究进展. 福建农业学报, 2006, 21(4):415
‑
419；吴克贤, 李伟, 徐妙珍,等. 长白落叶松组织培养的研究. 林业科学, 1996, 32(2):125
‑
133；张素清. 落叶松属树种组织培养的研究进展. 辽宁林业科技，2015，1：56
‑
58）。但对于落叶松的组织培养一直没有太大的突破，近些年有研究人员对此进行了探索，例如张莉以成熟合子胚为材料,对杂种落叶松和长白落叶松进行了离体再生及其内源激素含量变化研究（张莉.长白落叶松离体再生体系的建立.山东林业科技,2019(02):17
‑
22.；张莉. 落叶松高效离体再生体系建立及内源激素变化研究.东北林业大学,2016）。郑武林比较研究了马尾松（Pinus massoniana Lamb.）成熟合子胚和下胚轴再生性能的基础上，以马尾松下胚轴为外植体，研究了影响马尾松下胚轴离体再生的多种因素，建立了马尾松下胚轴离体再生体系（郑武林.马尾松与落叶松高效离体再生体系建立.江西农业大学,2014.）；祝朋芳等以日本落叶松嫩茎为外植体进行离体培养,探讨了各因素对诱导腋芽分化的影响并进行了扩繁继代的研究，结果表明基本培养基以ZN及SH最适;细胞分裂素以KT最适,其次为2ip（祝朋芳,陈长青,张惠华,罗凤霞,孙晓梅.日本落叶松的离体培养和植株再生.辽宁农业科学,2002(01):21
‑
23）。
[0005]目前的研究主要合子胚或下胚轴为外植体，其来源易于受限制，并且再生效果有待提高，实用性还不够强，尚不能推广应用。由此可知，申请人此前针对以落叶松肥厚的针叶为起始材料，经培养产生大量的不定芽，能够在短时间内获得大量落叶松再生植株,植株表型一致性高，而且这种种苗的发生不受季节限制（CN2019109073388）。但仍然需要找到更为高效的再生体系并用于采穗圃的建立。

技术实现思路

[0006]本专利技术以落叶松芽点为外植体进行了离体再生研究，诱导了定芽芽点的萌动和伸长，获得了快速伸长植株，进一步高效诱导了定芽芽点产生，为市场提供一种不受季节限制，快捷再生的循环培养方法。该方法可用于建立高效的离体采穗圃体系，单次循环8周，繁殖系数为7，芽苗数量呈几何级数增加，周年生产高活力的复幼枝条。
[0007]因此，本专利技术提供一种落叶松高效离体再生方法，其包括如下步骤：（1）将落叶松无菌苗转接到DCR+0.4
‑
0.8mg/L6
‑
苄氨基嘌呤(BA)+0.04
‑
0.08 mg/L萘乙酸(NAA)，培养1
‑
3周，获得带少量芽点半木质化落叶松伸长苗，将芽点连同其附着部分的茎段切下作为起始外植体；（2）将步骤（1）中所得的茎段接种于附含有0.1
‑
3mg/LBA，0.01
‑
0.3 mg/LNAA，0
‑
4g/L 活性炭（AC）的DCR培养基上，培养2周后，促进定芽芽点萌动与初步分化；优选添加0.5
‑
2 mg/LBA，0.05
‑
0.2 mg/L NAA，1
‑
3 g/L AC。
[0008]（3）将步骤（2）所得的材料接入附含有0.5
‑
5mg/L吲哚丁酸(IBA)的DCR培养基中，培养2
‑
4周后，落叶松茎段伸长；优选地，培养条件光照（60 μmol
∙
m
‑2∙
s
‑1）16 h/d培养，培养温度为25
±
2℃。优选添加1
‑
4 mg/L IBA，伸长效果最好。
[0009]（4）将步骤（3）获得的幼嫩落叶松伸长苗转入附含有0.5
‑
5mg/LIBA，0.1
‑
0.8mg/L乙烯利（ETH）的DCR培养基上培养2
‑
4周后，诱导出形态清晰的离体腋芽；优选地，光照培养（60 μmol
∙
m
‑2∙
s
‑1）16 h/d，培养温度为25
±
2℃。优选添加DCR+2
‑
4 mg/L IBA+0.1
‑
0.5mg/L ETH。
[0010]（5）将步骤（4）获得的芽点连同其附着茎段切下后，重复步骤（3）
‑
（4）循环培养，直到可获得伸长芽苗；（6）将步骤（5）获得的伸长芽苗切下，转入附含有0.5
‑
5 mg/L IBA、25
‑
200mg/L 间苯三酚（PG）和0
‑
2g/L AC的DCR培养基中培养4
‑
8周后诱导出不定根、木质化较高的再生植株苗；优选地，光照培养（60μmol
∙
m
‑2∙
s
‑1）16 h/d，培养温度为25
±
2℃。优选生根培养基配方为DCR+2
‑
4mg/L IBA+50
‑
150 mg/L PG。
[0011]其中，需要说明如下：一是，本专利技术前期探索实验表明，添加活性炭有助于芽点的萌发以及萌发新芽叶的伸展，因而步骤（2）和（3）中在培养其中添加了活性炭，获得了较好的效果。二是在组培中乙烯是一种很少应用激素，公认的作用为促进成熟和衰老。少部分的报道的主要集中在乙烯诱导不定根的发生，促进根系吸收等。目前没有将乙烯利应用于落叶松离体再本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种落叶松高效离体再生苗的获得方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将落叶松无菌苗培养获得带少量芽点半木质化落叶松伸长苗，将芽点连同其附着部分的茎段切下作为起始外植体；（2）将步骤（1）中所得的茎段接种于附含有0.1
‑
3mg/LBA，0.01
‑
0.3 mg/LNAA，0
‑
4g/L 活性炭的DCR培养基上，促进定芽芽点萌动与初步分化，光照培养时间1
‑
3周；（3）将步骤（2）所得的材料接入附含有0.5
‑
5mg/LIBA的DCR培养基中，光照培养2
‑
4周后，落叶松茎段伸长；（4）将步骤（3）获得的幼嫩落叶松伸长苗转入附含有0.5
‑
5mg/LIBA，0.1
‑
0.8mg/L乙烯利的DCR培养基上，光照培养2
‑
4周，诱导出形态清晰的离体腋芽；（5）将步骤（4）获得的芽点连同其附着茎段切下后，重复步骤（3）
‑
（4）循环培养，直到获得伸长芽苗，获得再生苗。2.如权利要求1所述的落叶松高效离体再生方法，其特征在于，还包括如下步骤：（6）将步骤（5）获得的伸长芽苗切下，转入附含有0.5
‑
5 mg/L IBA、25
‑
200mg/L间苯三酚和0
‑
2g/L 活性炭的DCR培养基中，光照培养诱导出不定根、木质化较高的再生植株苗。3.如权利要求1所述的落叶松高效离体再生方法，其特征在于，所述步骤（1）的具体操作是：将落叶松无菌苗转接到添加0.4
‑
0.8mg/LBA+0.04
‑
0.08 mg/LNAA的DCR培养基中，培养获得带少量芽点半木质化落叶松伸长苗。4.如权利要求1所述的落叶松高效离体再生方法，其特征在于，所述步骤（2）中，DCR培养基中添加0.5
‑
2 mg/LBA，0.05
‑
0.2 mg/L NAA，2 g/L 活性炭...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫学彤，朱木兰，齐力旺，郑珂媛，
申请(专利权)人：中国科学院分子植物科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：