一种稳定高效的木薯种质资源离体保存方法技术

本发明专利技术属于植物组织培养技术领域，公开了一种稳定高效的木薯种质资源离体保存方法，对木薯外植体灭菌后用洗衣粉浸泡并用自来水冲洗，用70％的异丙醇、汞溶液以及无菌蒸馏水浸泡冲洗，用戊二醛加吐温80进行消毒；分别进行MS培养基、芽诱导培养基和固体继代培养基的制备；将木薯种质资源置于超净工作台上切成茎块，接种于MS培养基进行培养，再接种于芽诱导培养基诱导出不定芽后，将不定芽转接至固体继代培养基进行初代培养；将木薯无菌试管苗在超净工作台上用解剖刀剔除叶片后，将茎杆切成小茎段，将茎段形态学下端插入固体继代培养基中进行慢生长保存。本发明专利技术工艺流程简单，节约了木薯种质资源保存的成本，延长离体培养物的保存时间。存时间。存时间。

【技术实现步骤摘要】
一种稳定高效的木薯种质资源离体保存方法


[0001]本专利技术属于植物组织培养
，尤其涉及一种稳定高效的木薯种质资源离体保存方法。

技术介绍

[0002]目前，木薯为大戟科(Euphorbiaceae)、木薯属(Manihot)植物，是生源作物，是生产酒精、淀粉的主要原料。该属有98个种，其中仅木薯(Manihot esculenta Crantz)一个栽培种，别名木蕃薯，树薯，英文名为Cassava。在美洲已有五千年的栽培史，是全球三大薯类作物之一，种植面积约1800万公顷，仅次于马铃薯，大于甘薯，分布于南北纬30
°
之间，海拔2000米以下，迄今，木薯被广泛种植在非洲(49％)、亚洲(28％)和美洲(23％)的95个国家和地区，成为解决饥饿和贫困的重要热带作物，为超过8亿人口提供必需的热能来源和基本生活保障。特别是近年来木薯成为重要的能源作物，是生产燃料乙醇最适宜的淀粉原料之一。我国现有木薯栽培面积约50万公顷，主要分布于广西、广东和海南等热带、亚热带省区，产量的90％用于淀粉生产，其潜在栽培面积在300万公顷以上。
[0003]木薯种质资源是遗传育种的基础，木薯属包括98个种，木薯的基因源包括了大约160个种。迄今绝大多数木薯种质资源来自热带美洲，部分来自非洲和东南亚国家。最近报告表明，大约20000的木薯种质和野生种被保存在国际热带农业中心、国际热带农业研究所和世界各地超过45个国家的国家保护区。
[0004]木薯的体外繁殖和保护技术虽然已经很好地在许多基因库中得到开发和应用。巴西、阿根廷、巴拉圭和古巴等国家项目计划中也积极推广离体保存技术。我国是木薯种质资源匮乏的国家，在农业部948等项目资助下，目前收集国内外木薯优良新品种和特异种质资源500多份，各级优良品系5000多份，引进国外特异种子6万多粒，建立国家级木薯种质资源圃，我们国家木薯种质圃900多份；同时也建立了木薯种质资源的离体保存技术和离体保存库。众所周知，低温或超低温保存设备成本大、耗能高，如何在常温培养条件(25
±
2℃，3000xl光照强度，16h/8h光周期)下让保存的种质以缓慢发育，达到延长继代周期，减低培养成本的目的，是当前种质资源离体保存技术的重大任务。
[0005]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有的木薯种质资源离体保存方法中，低温或超低温保存设备成本大、耗能高。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种稳定高效的木薯种质资源离体保存方法。
[0007]本专利技术是这样实现的，一种稳定高效的木薯种质资源离体保存方法，所述稳定高效的木薯种质资源离体保存方法包括以下步骤：
[0008]步骤一，进行木薯种质资源外植体的预处理：获取木薯种质资源外植体，对木薯外植体灭菌后用洗衣粉浸泡并用自来水冲洗；将木薯外植体依次用70％的异丙醇、汞溶液以
及无菌蒸馏水进行浸泡、冲洗后，再用2.0％的戊二醛加3滴吐温80进行消毒处理，获得预处理后的木薯种质资源；
[0009]步骤二，进行木薯种质资源专用培养基的制备：将木薯种质资源离体保存专用槽进行灭菌处理后，分别进行MS培养基、芽诱导培养基和固体继代培养基的制备；灭菌处理后将所述MS培养基、芽诱导培养基和固体继代培养基分别置于木薯种质资源离体保存专用槽的分隔槽内备用；
[0010]步骤三，进行木薯种质资源的接种和诱导培养：将预处理后的木薯种质资源置于超净工作台上切成茎块，切除多余部分，保留完整芽眼；先接种于MS培养基进行培养，再接种于芽诱导培养基诱导出不定芽后，将不定芽转接至固体继代培养基进行初代培养，获得木薯无菌试管苗；
[0011]步骤四，进行木薯种质资源的离体保存：将木薯无菌试管苗在超净工作台上用解剖刀剔除叶片后，将茎杆切成小茎段，每段包含一个节间；将茎段形态学下端插入固体继代培养基中，置于中温、中光条件下进行培养，再置于低温、弱光的培养条件下，继续进行慢生长保存。
[0012]进一步，所述步骤一中的木薯种质资源外植体的预处理方法包括：
[0013](1)在大田或实验室的盆栽苗中获取生长健壮、无病虫害的木薯种质资源外植体，并对所述木薯种质资源外植体进行灭菌处理；
[0014](2)在灭菌处理后的木薯种质资源外植体上切取木薯带芽嫩茎，除去叶片和部分叶柄后，用洗衣粉浸泡15～30min后，再用自来水冲洗20～40min；
[0015](3)将冲洗后的木薯带芽嫩茎置于超净工作台上用浓度为70％的异丙醇浸泡8～12s，再放入0.5％升汞溶液中浸泡10～20min；
[0016](4)浸泡结束后，将木薯带芽嫩茎用无菌蒸馏水冲洗3～6次，再用2.0％的戊二醛加3滴吐温80消毒处理8～12min，获得预处理后的木薯种质资源。
[0017]进一步，所述用2.0％的戊二醛加3滴吐温80消毒处理期间，不断摇动使茎段充分接触消毒溶液；消毒处理后，再用无菌蒸馏水冲洗3～4次，并用滤纸吸干所述木薯种质资源表面水分后备用。
[0018]进一步，所述步骤二中的木薯种质资源专用培养基的制备方法包括：
[0019](1)将木薯种质资源离体保存专用槽进行灭菌处理后备用；
[0020](2)利用MS为基础培养基，并添加大量元素、苄氨基腺嘌呤1.0～1.5mg/L、萘乙酸0.1～0.3mg/L，调节pH值为5.5～6.0，得到芽诱导培养基；
[0021](3)利用MS为基础培养基，并添加NAA 0.2～0.4mg/L、Kana 60～80mg/L、蔗糖20～30g/L、琼脂8～12g/L，调节pH为5.8，得到固体继代培养基；
[0022](4)对MS培养基、芽诱导培养基和固体继代培养基进行灭菌处理后，将MS培养基、芽诱导培养基和固体继代培养基分别置于木薯种质资源离体保存专用槽的分隔槽内备用。
[0023]进一步，所述大量元素由NHNO、KNO、KHPO、MgSO
·
7HO和CaCl
·
2HO组成。
[0024]进一步，所述步骤三中的木薯种质资源的接种和诱导培养方法包括：
[0025](1)将预处理后的木薯种质资源置于超净工作台上切成长10～15cm3的小茎块，每块包含一个芽茎，保留完整芽眼；
[0026](2)切除木薯种质资源的叶柄和茎段上、下端多余的部分，接种于MS培养基，培养2
～4d后，接种于芽诱导培养基诱导出不定芽；
[0027](3)待诱导的不定芽长至2～3cm高时，将不定芽从瓶中取出，切成单株并转接至固体继代培养基中进行初代培养，获得木薯无菌试管苗。
[0028]进一步，所述步骤(2)中的诱导培养条件包括：
[0029]设置诱导培养温度为25～27℃、光照强度为1200～1600lx，设置光培养周期为8～12h或暗培养周期为10～14h。
[0030]进一步，所述步骤(3)中的继代培养条件包括：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种稳定高效的木薯种质资源离体保存方法，其特征在于，所述稳定高效的木薯种质资源离体保存方法包括以下步骤：步骤一，进行木薯种质资源外植体的预处理：获取木薯种质资源外植体，对木薯外植体灭菌后用洗衣粉浸泡并用自来水冲洗；将木薯外植体依次用70％的异丙醇、汞溶液以及无菌蒸馏水进行浸泡、冲洗后，再用2.0％的戊二醛加3滴吐温80进行消毒处理，获得预处理后的木薯种质资源；步骤二，进行木薯种质资源专用培养基的制备：将木薯种质资源离体保存专用槽进行灭菌处理后，分别进行MS培养基、芽诱导培养基和固体继代培养基的制备；灭菌处理后，将所述MS培养基、芽诱导培养基和固体继代培养基分别置于木薯种质资源离体保存专用槽的分隔槽内备用；步骤三，进行木薯种质资源的接种和诱导培养：将预处理后的木薯种质资源置于超净工作台上切成茎块，切除多余部分，保留完整芽眼；先接种于MS培养基进行培养，再接种于芽诱导培养基诱导出不定芽后，将不定芽转接至固体继代培养基进行初代培养，获得木薯无菌试管苗；步骤四，进行木薯种质资源的离体保存：将木薯无菌试管苗在超净工作台上用解剖刀剔除叶片后，将茎杆切成小茎段，每段包含一个节间；将茎段形态学下端插入固体继代培养基中，置于中温、中光条件下进行培养，再置于低温、弱光的培养条件下，继续进行慢生长保存。2.如权利要求1所述稳定高效的木薯种质资源离体保存方法，其特征在于，所述步骤一中的木薯种质资源外植体的预处理方法包括：(1)在大田或实验室的盆栽苗中获取生长健壮、无病虫害的木薯种质资源外植体，并对所述木薯种质资源外植体进行灭菌处理；(2)在灭菌处理后的木薯种质资源外植体上切取木薯带芽嫩茎，除去叶片和部分叶柄后，用洗衣粉浸泡15～30min后，再用自来水冲洗20～40min；(3)将冲洗后的木薯带芽嫩茎置于超净工作台上用浓度为70％的异丙醇浸泡8～12s，再放入0.5％升汞溶液中浸泡10～20min；(4)浸泡结束后，将木薯带芽嫩茎用无菌蒸馏水冲洗3～6次，再用2.0％的戊二醛加3滴吐温80消毒处理8～12min，获得预处理后的木薯种质资源。3.如权利要求2所述稳定高效的木薯种质资源离体保存方法，其特征在于，所述用2.0％的戊二醛加3滴吐温80消毒处理期间，不断摇动使茎段充分接触消毒溶液；消毒处理后，再用无菌蒸馏水冲洗3～4次，并用滤纸吸干所述木薯种质资源表面水分后备用。4.如权利要求1所述稳定高效的木薯种质资源离体保存方法，其特征在于，所述步骤二中的木薯种质资源专用培养基的制备方法包括：(1)将木薯种质资源离体保存专用槽进行灭菌处理后备用；(2)利用MS为基础...

【专利技术属性】
技术研发人员：付海天，黄建祺，赵英，韦祖生，文峰，李军，罗燕春，俞奔驰，韦丽君，宋恩亮，卢赛清，陈炯宇，雷开文，
申请(专利权)人：广西壮族自治区亚热带作物研究所广西亚热带农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：