一种利用大桥虎耳草叶柄获得再生植株的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用大桥虎耳草叶柄获得再生植株的方法，S1、选取大桥虎耳草无病虫害的植株，摘取叶柄，去掉叶片，对叶柄表面进行消毒；S2、将叶柄切成长约1cm，接种于愈伤组织诱导培养基上；S3、将诱导的愈伤组织切割后，转接到分化培养基上进行分化培养；S4、将分化的不定芽转接到芽增殖培养基上进行培养，获得大量的不定芽，增殖系数4倍以上；S5、将有明显生长点的不定芽转接到生根培养基上，进行生根培养，再生植株每株根数5

【技术实现步骤摘要】
一种利用大桥虎耳草叶柄获得再生植株的方法


[0001]本专利技术涉及植物组织培养
，更具体地说，它涉及一种利用大桥虎耳草叶柄获得再生植株的方法。

技术介绍

[0002]大桥虎耳草(Saxifraga daqiaoensis F.G.Wang et F.W.Xing)为虎耳草科，多年生草本植物，目前仅在广东韶关乳源大桥、秤架东坑深坑石灰岩岩壁发现2个居群，植株数量极少，处于濒危(EN)状态为广东特有种。其对环境要求较高，生境特殊，生于海拔150
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350m的石灰岩山地潮湿岩石上。植株高12
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18cm。根状茎较短，茎无毛。基生叶无毛，盾状着生，肾形至圆形，革质，边缘疏被锯齿或近全缘，背面具紫褐色斑点。茎生叶少，披针状至卵状。花白色，花期3
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5月。虎耳草植物具有较高的环境绿化价值，已经应用于小盆栽培，垂直绿化及林下地被产品。还具有较高的药用价值，有清热，凉血解毒，治风疹，湿疹，中耳炎，丹毒，咳嗽吐血，肺痈，崩漏，痔疾等功效。另外，还具有调控前列腺细胞的生长与细胞凋亡，保护肝脏、抗癌，抗氧化等作用。
[0003]虎耳草植物多采用播种和分株繁殖。其种子较小，通常很难采集到较多的种子，种子发芽率低。分株繁殖通常利用匍匐茎顶端的芽可以产出新的不定芽和不定根进行繁殖。而大桥虎耳草比较特殊，没有匍匐茎，自身分株繁殖数量少较慢。虎耳草植物组织培养繁殖的研究有少量报道。但大桥虎耳草的组培技术的研究的未见相关报道。
[0004]由于受到生态环境和人为破坏,大桥虎耳草野生植株目前较少，对其资源的保护和离体保存的研究具有重要的现实意义。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种利用大桥虎耳草叶柄获得再生植株的方法，建立了大桥虎耳草离体培养再生体系，为物种的资源的保护，保存及繁殖利用提供有效的途径，为大桥虎耳草的遗传改良的研究奠定基础。
[0006]本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
[0007]一种利用大桥虎耳草叶柄获得再生植株的方法，具体步骤如下：
[0008]S1、材料处理及表面消毒：采集并种植大桥虎耳草野生植株，取大桥虎耳草叶柄，去除叶片，将叶柄冲洗干净后，浸没在新洁尔灭溶液中搅拌，然后取出至酒精溶液中短暂浸泡，然后使用灭菌水多次清洗，随后将叶柄浸泡在氯化汞溶液中进行消毒；
[0009]S2、愈伤组织的诱导培养：将经过表面消毒的叶柄切成条状作为外植体，将外植体接种至诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，培养温度维持室温，暗培养诱导出愈伤组织；
[0010]S3、愈伤组织的分化培养：将叶柄诱导的愈伤组织切割后，接于分化培养基上进行分化培养，置于培养室内，培养温度维持室温，保持光照，光照时间为12h/d,诱导出不定芽；
[0011]S4、不定芽的增殖培养：将分化出的不定芽切分后转移到芽增殖培养基进行芽的增殖培养，置于培养室内，维持室温培养并维持光照，光照时间为12h/d；
[0012]S5、生根培养：将增殖的不定芽切分为单芽后转入生根培养基中，置于培养室，维持室温暗培养，诱导出根系；
[0013]S6、将带有根系的新芽种植，培养出新的大桥虎耳草植株。
[0014]在其中一个实施例中，所述诱导培养基，分化培养基，芽增殖培养基和生根培养基均含有改良MS培养基，所述改良MS培养基为NH4NO3、KNO3、MgSO4·
7H2O和KH2PO4含量减半，CaCl2·
2H2O含量不变的MS培养基。
[0015]在其中一个实施例中，在步骤S2中，所述诱导培养基的组分及含量为：改良MS培养基、1～4mg/L的6
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BA、0.2～1mg/L的NAA、2g/L的PVP、30g/L蔗糖和6～7g/L琼脂粉；或改良MS培养基、1～2mg/L的KT、0.2～0.5mg/L的NAA、2g/L的PVP、30g/L蔗糖和琼脂粉6～7g/L；或改良MS培养基、0.1～0.2mg/L的TDZ、0.2～0.5mg/L的NAA、2g/L的PVP、30g/L的蔗糖和6～7g/L的琼脂粉。
[0016]在其中一个实施例中，在步骤S3中，所述分化培养基的组分及含量为：改良MS培养基、1～4mg/L的6
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BA、0.1～0.2mg/L的NAA、2g/L的PVP、30g/L蔗糖和6～7g/L的琼脂粉。
[0017]在其中一个实施例中，步骤S4中，将分化出的不定芽切分后，每组含有2～3芽，转移到芽增殖培养基。
[0018]在其中一个实施例中，所述芽增殖培养基的组分及含量为：改良MS培养基、2～3mg/L的6
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BA、0.2mg/L的NAA、30mg/L的蔗糖和6～7g/L的琼脂；或改良MS培养基、0.2～0.3mg/L的TDZ、0.2mg/L的NAA、30g/L的蔗糖和6～7g/L的琼脂粉。
[0019]在其中一个实施例中，在步骤S5中，所述生根培养基的组分及含量为：改良MS培养基、0.2～0.5mg/L的NAA、30g/L的蔗糖和6～7g/L的琼脂粉；或MS、0.2～0.5mg/L的IBA、30g/L的蔗糖和6～7g/L的琼脂粉。
[0020]在其中一个实施例中，所述诱导培养基，分化培养基，芽增殖培养基和生根培养基的pH值均为5.8～6.0。
[0021]在其中一个实施例中，在步骤S2中，将经过表面消毒的叶柄切成长度在1
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1.5cm长条状作为外植体，而且将外植体平放接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养。
[0022]在其中一个实施例中，在步骤S3和步骤S4中，光照强度均为1500
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2000LX。
[0023]综上所述，本专利技术具有以下有益效果：
[0024]本专利技术以大桥虎耳草叶柄作为外植体，配置添加了细胞分裂素6
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BA，KT和TDZ与生长素NAA组合的诱导培养基，诱导愈伤组织，诱导率达80％以上，可不伤害或少伤害母株，适用于野生材料稀少的种质的繁殖利用，还可应用于大桥虎耳草的遗传转化研究；本专利技术的分化培养中，愈伤组织的不定芽分化率在80％以上，大大提高了不定芽分化的数量，在不定芽增殖的培养中，不定芽的增殖率达到80％以上。在某种程度上决定了愈伤组织再生植株的效率，试管苗生根率可达100％，植株生长健壮，根系发达，为其后期的遗传转化研究奠定了基础。
附图说明
[0025]图1中，A：野外取材移栽到大棚的大桥虎耳草开花；B：叶柄诱导出愈伤组织；C：愈伤组织分化出不定芽；D：不定芽增殖出较多芽；E：根系的生长状态；F：生根的植株。
具体实施方式
[0026]下面结合实施例，对本专利技术进行详细描述。
[0027]目前由于受到生态环境恶化和人为破坏,大桥虎耳草野生植株已濒临灭绝，大桥虎耳草主要依靠种子繁殖的方式进行繁育，其繁殖数量少，繁殖速度慢，被认为是导致其稀少的原因之一。因此，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用大桥虎耳草叶柄获得再生植株的方法，其特征在于，步骤如下：S1、材料处理及表面消毒：采集并种植大桥虎耳草野生植株，取大桥虎耳草叶柄，去除叶片，将叶柄冲洗干净后，浸没在新洁尔灭溶液中搅拌，然后取出至酒精溶液中短暂浸泡，然后使用灭菌水多次清洗，随后将叶柄浸泡在氯化汞溶液中进行消毒；S2、愈伤组织的诱导培养：将经过表面消毒的叶柄切成条状作为外植体，将外植体接种至诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，培养温度维持室温，暗培养诱导出愈伤组织；S3、愈伤组织的分化培养：将叶柄诱导的愈伤组织切割后，接于分化培养基上进行分化培养，置于培养室内，培养温度维持室温，保持光照，光照时间为12h/d,诱导出不定芽；S4、不定芽的增殖培养：将分化出的不定芽切分后转移到芽增殖培养基进行芽的增殖培养，置于培养室内，维持室温培养并维持光照，光照时间为12h/d；S5、生根培养：将增殖的不定芽切分为单芽后转入生根培养基中，置于培养室，维持室温暗培养，诱导出根系；S6、将带有根系的新芽种植，培养出新的大桥虎耳草植株。2.如权利要求1所述的利用大桥虎耳草叶柄获得再生植株的方法，其特征在于，所述诱导培养基，分化培养基，芽增殖培养基和生根培养基均含有改良MS培养基，所述改良MS培养基为NH4NO3、KNO3、MgSO4·
7H2O和KH2PO4含量减半，CaCl2·
2H2O含量不变的MS培养基。3.如权利要求2所述的利用大桥虎耳草叶柄获得再生植株的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述诱导培养基的组分及含量为：改良MS培养基、1～4mg/L的6
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BA、0.2～1mg/L的NAA、2g/L的PVP、30g/L蔗糖和6～7g/L琼脂粉；或改良MS培养基、1～2mg/L的KT、0.2～0.5mg/L的NAA、2g/L的PVP、30g/L蔗糖和琼脂粉6～7g/L；或改良MS培养基、0.1～0.2mg/L的TDZ、0.2～0.5mg/L的NAA、2g/L的PVP、30...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩伟，
申请(专利权)人：韶关学院，
类型：发明
国别省市：