高通量自动化富集蛋白质和/或肽段组的质谱鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种高通量自动化富集蛋白质和/或肽段组的质谱鉴定方法，该方法可基于机械臂与多孔筛板实现高通量自动化处理样本的过程，流程包括：包括将样本置于装有磁性纳米材料多孔筛板中，在自动化平台上进行纳米材料与蛋白的结合、非特异性蛋白的清洗、蛋白的还原烷基化与酶解、采用有机溶剂纯化除盐以及制备成蛋白质组样品，最后进行质谱检测，整个处理流程仅需4h左右即可完成。本发明专利技术方法能够增加批次样本提取数量，有效缩短样本处理时间，且整个样本制备流程仅在一个样品管里即可完成，实现样本便捷快速高通量处理。实现样本便捷快速高通量处理。实现样本便捷快速高通量处理。

【技术实现步骤摘要】
高通量自动化富集蛋白质和/或肽段组的质谱鉴定方法


[0001]本专利技术属于蛋白组学
，具体地，涉及一种高通量自动化富集蛋白质和/或肽段组的质谱鉴定方法。

技术介绍

[0002]人体体液是疾病相关蛋白的丰富来源，这些蛋白质从全身的病理组织中分泌或泄漏，许多可通过非侵入性方法获得。近些年来，研究者通过检查体液蛋白质组发现大量生物标志物，通过创新的高通量技术，现代蛋白质组学研究已经成功地在各种体液(如血浆、血清、唾液和尿液)中鉴定出大量蛋白质，成果显著。随着蛋白质组学的发展，其相应的体液蛋白质组学质谱检测能力也在快速发展，样本通量迅速变大，从以前单样本采集时间90
‑
180min，目前可以缩减到10min完成单样本数据采集，同时数据分析平台也在往云平台发展，上千样本同时处理仅需几天时间。然而，样本前处理目前还处在耗时长、效率低的单个样本操作阶段，此时，提高每批次样本数量及方法优化显得尤为重要。
[0003]目前提取体液样本蛋白质组的方法，需要每个样本单独操作，存在操作繁琐、耗时长、通量小、样本见稳定性差等问题。比如：使用Seer公司生产的Proteograph Assay Kit，每16个样本操作时间大约为7h左右；使用ThermoFisher公司生产的High
‑
Select
TM Top14丰度蛋白去除中型离心柱，每个样本单独使用Top14丰度蛋白去除中型离心柱提取血清/血浆样本蛋白质组，工作需耗时至少6
‑
8h，而每个人每批次最多操作24个样本，同时耗时会增加为每批次2h。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：针对目前体液蛋白质及肽段组样品制备方法的局限性，本专利技术提供了一种高通量自动化富集蛋白质和/或肽段组的质谱鉴定方法。
[0005]技术方案：为达到上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种高通量自动化富集蛋白质和/或肽段组的质谱鉴定方法，包括以下步骤：包括将样本置于装有磁性纳米材料多孔筛板中，在自动化平台上进行纳米材料与蛋白的结合、非特异性蛋白的清洗、蛋白的裂解还原烷基化与酶解、纯化除盐以及制备成蛋白质组样品，最后进行质谱检测。
[0007]优选的，所述待测样本选自不同物种、部位、纯化手段来源的蛋白纯化物、蛋白质组、肽纯化物或肽组，如：血清，血浆，全血，尿液，脑脊液，唾液，胸腔液，肺积水，腹水，胃液，胆汁，胰液，泪液，汗液，脓液，积液，淋巴液，细胞培养液等各类体液，优选血清，血浆和全血。
[0008]优选的，所述多孔筛板为96孔，可选1
‑
96孔。
[0009]优选的，所述磁性纳米材料选自磁性分子筛材料和或磁性聚苯乙烯材料，所述磁性分子筛材料中的分子筛材料选自A型、Z型、Y型或丝光沸石型中的一种或几种的混合物，优选磁性Y型分子筛；所述磁性聚苯乙烯材料选自聚苯乙烯、羧基聚苯乙烯、氨基聚苯乙烯
以及磺酸基聚苯乙烯材料中的一种或几种的混合，优选磁性羧基聚苯乙烯材料。
[0010]进一步优选的，所述磁性分子筛材料通过以下方法制备：
[0011]将分子筛材料与可溶性铁盐溶液进行离子交换，分离出固体，干燥，焙烧，即得到所述磁性纳米分子筛材料。
[0012]所述磁性聚苯乙烯材料通过以下方法制备：
[0013]制备油酸改性的Fe3O4，在惰性气氛保护下，将引发剂和苯乙烯类单体，搅拌并充分溶解后，加入油酸改性的Fe3O4，使其分散得到分散液，然后加入乳化剂和去离子水，搅拌混合均匀，进行水热反应，产物经洗涤、干燥，得到纳米聚苯乙烯微球，即为所述磁性聚苯乙烯材料；如上述反应过程中，引入羧基，氨基，磺酸基等功能单体进行改性反应，即可获得磁性羧基聚苯乙烯、磁性氨基聚苯乙烯以及磁性磺酸基聚苯乙烯材料。
[0014]更优选的，所述磁性聚苯乙烯材料制备过程中，水热反应的条件为：升温到80
‑
90℃并保持该温度反应1.5
‑
2.5h，升温至90
‑
100℃，保持25
‑
35min，降温至85
‑
90℃，继续反应4
‑
6h。
[0015]更具体地，所述磁性聚苯乙烯材料通过以下方法制备：
[0016]a.将油酸溶解于无水乙醇中，配成一定浓度的油酸
‑
乙醇溶液，取适量的Fe3O4粉末，与油酸
‑
乙醇溶液置于三口烧瓶中，水浴加热至40
‑
50℃，保持约3
‑
4h，过滤，干燥，得到油酸改性的Fe3O4。
[0017]b.惰性气氛保护下，将引发剂和苯乙烯类单体，搅拌并充分溶解后，加入油酸改性的Fe3O4，超声振荡,使其分散得到黑色分散液，然后加入乳化剂和去离子水，搅拌混合均匀，缓慢升温(约40min)到85℃并保持该温度反应2h，升温至95℃，保持30min，降温至90℃，继续反应5h，产物经洗涤、干燥，得到纳米聚苯乙烯微球，即为所述磁性聚苯乙烯材料。
[0018]c.如上述反应过程中，引入羧基，氨基，磺酸基等功能单体进行改性反应，即可获得磁性羧基聚苯乙烯、磁性氨基聚苯乙烯以及磁性磺酸基聚苯乙烯材料。
[0019]优选的，所述的用于高通量自动化富集蛋白质和/或肽段组的质谱鉴定方法，包括以下步骤：
[0020](1)磁性纳米材料与蛋白结合：将待测样本置于装有磁性纳米材料多孔筛板中，加入结合缓冲液，得到混悬液，在自动化平台上进行孵育后，利用磁力吸附沉淀，保留沉淀Ⅰ，并去除上清液；
[0021](2)非特异性结合蛋白的清洗：在自动化平台上，向保留沉淀Ⅰ的多孔筛板中加入清洗缓冲液重悬所述沉淀Ⅰ重悬得到重悬液，将所述重悬液孵育后，利用磁力吸附沉淀，保留沉淀II，并除去上清液，重复该步骤数次；
[0022](3)样本蛋白处理与酶解：在自动化平台上，向保留沉淀II的多孔筛板中加入裂解液和还原烷基化试剂，进行还原烷基化操作，然后加入胰蛋白酶进行酶解；
[0023](4)肽段除盐：酶解完成后，在自动化平台上，使用有机溶剂，基于磁性纳米材料，结合多孔筛板磁力架进行纯化除盐与解吸附，制备成蛋白质组/肽段组样品，进行质谱检测。
[0024]进一步优选的，步骤(1)中，所述磁性纳米材料与蛋白结合后，所述利用磁力吸附沉淀的时间为1～3min，优选为1min。
[0025]进一步优选的，步骤(2)中，非特异性结合蛋白的清洗后，所述利用磁力吸附沉淀
的时间为1～3min，优选为1min，该步骤重复3次。
[0026]进一步优选的，步骤(3)中，所述还原烷基化试剂包括还原剂和烷基化试剂，还原试剂为二硫苏糖醇或三(2
‑
羧乙基)膦；所述烷基化试剂为碘乙酰胺或氯乙酰胺；加入所述还原试剂后于95℃条件下反应5～30min，再加入烷基化试剂避光室温反应5～30min；或为10mM TCEP三(2
‑
羧乙基)膦+本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高通量自动化富集蛋白质和/或肽段组的质谱鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：包括将样本置于装有磁性纳米材料多孔筛板中，在自动化平台上进行纳米材料与蛋白的结合、非特异性蛋白的清洗、蛋白的还原烷基化与酶解、采用有机溶剂纯化除盐以及制备成蛋白质组样品，最后进行质谱检测。2.根据权利要求1所述的高通量自动化富集蛋白质和/或肽段组的质谱鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待测样本选自不同物种、部位、纯化手段来源的蛋白纯化物、蛋白质组、肽纯化物或肽组，如：血清，血浆，全血，尿液，脑脊液，唾液，胸腔液，肺积水，腹水，胃液，胆汁，胰液，泪液，汗液，脓液，积液，淋巴液，细胞培养液等各类体液，所述磁性纳米材料选自磁性分子筛材料和或磁性聚苯乙烯材料，磁性分子筛材料中的分子筛材料选自A型、Z型、Y型或丝光沸石型中的一种或几种的混合物；磁性聚苯乙烯材料选自磁性聚苯乙烯、磁性羧基聚苯乙烯、磁性氨基聚苯乙烯以及磁性磺酸基聚苯乙烯材料中的一种或几种的混合。3.根据权利要求2所述的高通量自动化富集蛋白质和/或肽段组的质谱鉴定方法，其特征在于，所述磁性分子筛材料通过以下方法制备：将分子筛材料与可溶性铁盐溶液进行离子交换，分离出固体，干燥，焙烧，即得到所述磁性纳米分子筛材料。所述磁性聚苯乙烯材料通过以下方法制备：制备油酸改性的Fe3O4，在惰性气氛保护下，将引发剂和苯乙烯类单体，搅拌并充分溶解后，加入油酸改性的Fe3O4，使其分散得到分散液，然后加入乳化剂和去离子水，搅拌混合均匀，进行水热反应，产物经洗涤、干燥，得到纳米聚苯乙烯微球，即为所述磁性聚苯乙烯材料；如上述反应过程中，引入羧基，氨基，磺酸基等功能单体进行改性反应，即可获得磁性羧基聚苯乙烯、磁性氨基聚苯乙烯以及磁性磺酸基聚苯乙烯材料。4.根据权利要求3所述的高通量自动化富集蛋白质和/或肽段组的质谱鉴定方法，其特征在于，所述磁性聚苯乙烯材料制备过程中，水热反应的条件为：升温到80
‑
90℃并保持该温度反应1.5
‑
2.5h，升温至90
‑
100℃，保持25
‑
35min，降温至85
‑
90℃，继续反应4
‑
6h。5.根据权利要求1所述的高通量自动化富集蛋白质和/或肽段组的质谱鉴定方法，其特征在于，包括以下流程：(1)磁性纳米材料与蛋白结合：将待测样本置于装有磁性纳米材料多孔筛板中，加入结合缓冲液，得到混悬液，在自动化平台上进行孵育后，利用磁力吸附沉淀，保留沉淀Ⅰ，并去除上清液；(2)非特异性结合蛋白的清洗：在自动化平台上，向保留沉淀Ⅰ的多孔筛板中加入清洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵娜，宋雷，陈亮宇，乔舰，李臻，赵薇，李捷，
申请(专利权)人：谱天天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：