一种疾病相关标志物的筛选方法、应用及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种疾病相关标志物的筛选方法、应用及试剂盒。筛选方法包括：使用能够结合免疫球蛋白(Ig)的物质，分别从第一批健康样本血清和患病样本血清中纯化出Ig复合物；将与Ig相结合的蛋白进行蛋白质谱测序分析，比较健康样本与患病样本的差异，找到只出现在患病样本中的差异蛋白，即为该疾病相关潜在标志物；最后，再进一步验证该潜在标志物：使用第二批健康样本和患病样本的血清(扩大病例)，纯化获得Ig复合物，利用差异蛋白的特异性抗体进行进一步鉴定。该方法先从血清中获得Ig复合物(而不是全血清)，再将与Ig相结合的蛋白进行蛋白质谱测序联合特异性抗体分析，能够快速有效地筛选出疾病相关标志物。筛选出疾病相关标志物。筛选出疾病相关标志物。

【技术实现步骤摘要】
一种疾病相关标志物的筛选方法、应用及试剂盒
[0001]本申请是申请日2021年11月11日，申请号202111329614.0，专利技术创造名称“一种疾病相关标志物的筛选方法、应用及试剂盒”的分案申请。


[0002]本专利技术涉及分子生物学与免疫学
，具体涉及一种疾病相关标志物的筛选方法、应用及试剂盒。

技术介绍

[0003]生物标志物(Biomarker)是指一种具有可客观检测和评价的特性，可作为正常生物学过程、病理过程或治疗干预药理学反应的指示因子的生物体内物质。在疾病的诊断和治疗研究中，寻找和发现有价值的生物标志物已经成为当前医学领域的研究热点。
[0004]公开号CN108956791A的专利公开了一种大规模筛选蛋白质生物标志物的方法：将生物组织对照样本和参考样本(病理样本)匀浆、裂解；裂解液进行酶解、除盐等操作；用LC
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MS/MS 液质联用的方式进行蛋白质鉴定；通过比较质谱分析次数或质谱峰强度，分析样品蛋白的丰度变化，以MS1为基础，计算每个肽段的信号强度在LC
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MS上的积分，以MS2的鉴定结果为定量基础，大规模对数据进行修正；通过修正的数据分析结果筛选出显著上调或下调的蛋白质生物标志物。
[0005]公开号CN111999403A的专利公开了一种瓦斯爆炸血清标志物筛选方法，以无创大鼠和瓦斯爆炸肺损伤大鼠血清样本进行LC
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MS检测，采用LC
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MS血清代谢组学技术进行分析，构建模型，利用模型进行数据处理，从候选代谢产物中筛选肺损伤模型生物标志物。
[0006]目前常用的筛选疾病相关特异性标志物的研究，普遍采用全基因组数据或者基因表达数据、全血清蛋白数据等作为分析基础。以新冠肺炎为例，目前通过蛋白质谱技术，已经揭示了重症COVID
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19患者血清中蛋白质和代谢物的特征变化，鉴定了一些可能具有应用潜质的标志分子。然而，几乎所有寻找特异性生物标志物的研究都是利用COVID
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19的全血清蛋白。对于蛋白质谱技术来说，由于其所用样品量少、而特异性标志物在血清或血浆含量却较低，显然，对于所需样本量少而为“优势”的蛋白质谱技术而言可谓是“大海捞针”，即要从这些目标分析物中筛选出有意义的标志物并非易事。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是针对现有技术中的上述问题，提供一种疾病相关潜在生物标志物的筛选方法、应用及试剂盒，该方法能够快速筛选出有意义的标志物，为疾病的诊断和治疗提供靶标基础。
[0008]第一方面，本专利技术提供了一种疾病相关潜在标志物的筛选方法，包括：
[0009](1)使用能够结合Ig(免疫球蛋白)的物质，分别从第一批健康样本血清和患病样本血清中纯化出Ig复合物；
[0010](2)对Ig复合物进行质谱分析和/或糖谱分析，比较健康样本与患病样本的分析结
果，找到只高频出现在患病样本的Ig复合物中与Ig相结合的差异蛋白，和/或只高频出现在患病样本的Ig复合物中的差异糖基，该差异蛋白和/或差异糖基即为该疾病相关的潜在标志物；
[0011](3)进一步扩大健康样本和患病样本的数量，采用与步骤(1)相同的方法纯化获得Ig 复合物，验证差异蛋白和/或差异糖基。
[0012]可选或优选的，上述方法中，所述验证的方法如下：
[0013]针对差异蛋白，利用该差异蛋白的特异性抗体，识别本步骤获得的Ig复合物中的差异蛋白，如果患病样品中该差异蛋白仍然高频出现或缺失，则进一步验证该差异蛋白为疾病相关的潜在标志物；
[0014]针对差异糖基，利用该糖基的结合物，或者糖谱分析，识别本步骤获得的Ig复合物的差异糖基，如果患病样本中该差异糖基仍然高频出现或缺失，则进一步验证该差异糖基为疾病相关的潜在标志物。
[0015]上述筛选方法中，所述的健康样本，是指能够区别于患病样本的样本，例如，想要筛选某种疾病A相关的标志物，那么健康样本可以使用正常未患病人的样本，也可以使用患有其他疾病例如疾病B而未患疾病A的人的样本，只要能够与该疾病有明显区别，未被诊断为该疾病的样本即可。
[0016]验证步骤中使用的是新一批的健康样本和患病样本，数量可进一步扩大，大于第一批健康样本和患病样本，由于质谱或糖谱分析成本较高，第一批样本的数量只需要能够找到差异蛋白和/或差异糖基即可，当差异蛋白、糖基找到以后，再进一步大批量对这些差异蛋白、糖基的标志物特性进行验证，所得结果准确性更佳，同时也能够降低成本。
[0017]上述方法中，所述的高频，是指相较于其他样本，出现或缺失频率具有显著性差异，即丰度呈现显著性差异。
[0018]Ig，immunoglobulin，即免疫球蛋白。所述能够结合Ig的物质，与血清中的Ig结合后，可以分离纯化出Ig复合物，该复合物除含有Ig外，还包含了血清中存在的能够与Ig结合的其他蛋白类物质，部分蛋白可能存在糖基化修饰，因此利用能够结合Ig的物质将能够与Ig 结合的蛋白进行了收集，再对这些蛋白进行蛋白质谱测序分析、糖谱分析，在分析结果中寻找其在健康样本和患病样本中的差异，就能够获得只高频在患病样本中出现的蛋白、糖基。最后利用免疫结合技术例如ELISA或Western blot或CBA流式等检测方法验证差异蛋白作为疾病相关标志物的可行性，对于差异糖基也可进一步针对性验证。
[0019]可选或优选的，上述方法中，所述能够结合Ig的物质，包括ProteinG、ProteinA、Jacalin、 Hitrap、抗人IgD、抗人IgE中的至少一种。
[0020]可选或优选的，上述方法中，所述Ig复合物，包括IgG复合物、IgA复合物、IgM复合物、IgD复合物和IgE复合物中的至少一种。
[0021]第二方面，本专利技术提供了差异蛋白和/或差异糖基作为潜在标志物在制备疾病诊断或治疗药物中的应用，所述差异蛋白和/或差异糖基由以上任一所述方法筛选获得。
[0022]可选或优选的，上述应用中，所述疾病包括感染性疾病、免疫相关疾病中的任何一种。
[0023]第三方面，本专利技术提供了一种检测试剂盒，用于辅助检测新冠肺炎，配合能够结合Ig的物质使用，所述试剂盒中包括抗CA1抗体、抗LRG1抗体、抗IgG
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IgA复合物抗体中的至少
一种。
[0024]第四方面，本专利技术提供了一种检测试剂盒，用于辅助检测脑胶质瘤，配合能够结合Ig的物质使用，其特征在于，所述试剂盒中包括抗S100
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A8的抗体。S100
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A8即后文中的ProteinS100
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A8。
[0025]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0026]本专利技术的筛选方法首先基于亲和纯化技术利用能够结合Ig的物质，从样本血清中纯化出 Ig复合物，再以Ig复合物中与Ig相结合的蛋白作为蛋白质谱测序技术的研究对象，通过测序分析不同的蛋白在健康样本和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种疾病相关潜在标志物的筛选方法，其特征在于，包括：(1)使用能够结合Ig的物质，分别从第一批健康样本血清和患病样本血清中纯化出Ig复合物；(2)对Ig复合物进行质谱分析和/或糖谱分析，比较健康样本与患病样本的分析结果，找到只在患病样本的Ig复合物中高频出现或缺失的与Ig相结合的差异蛋白，和/或只在患病样本的Ig复合物中高频出现或缺失的差异糖基，该差异蛋白和/或差异糖基即为该疾病相关的潜在标志物；(3)进一步扩大健康样本和患病样本的数量，采用与步骤(1)相同的方法纯化获得Ig复合物，验证差异蛋白和/或差异糖基。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述验证方法为：针对差异蛋白，利用该差异蛋白的特异性抗体，识别本步骤获得的Ig复合物中的差异蛋白，如果患病样品中该差异蛋白仍然高频出现或缺失，则进一步验证该差异蛋白为疾病相关的潜在标志物；针对差异糖基，利用该糖基的结合物，或者糖谱分析，识别本步骤获得的Ig复合物的差异糖基，如果患病样本中该差异糖基仍然高频出现或缺失，则进一步验证该差异糖基为疾病相关的潜在标志物。3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的能够结合Ig的物质，包括ProteinG、ProteinA、Jacalin、Hitrap、抗人IgD、抗人IgE中的至少一种。4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述Ig复合物，包括IgG复合物、IgA复合物、IgM复合物、IgD复合物和IgE复合物中的至少一种。5.差异蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱晓彦，段富刚，朱珠，戴慧，张奕潇，王一凡，姜文华，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：