含有水凝胶式缓释载体的靶向肿瘤疫苗试剂盒制造技术

一种含有水凝胶式缓释载体的靶向肿瘤疫苗试剂盒，属于生物技术领域。本发明专利技术的目的是可缓慢持续释放溶瘤CRAd

【技术实现步骤摘要】
ID NO：3。
[0008]本专利技术所述溶瘤病毒为溶瘤腺病毒CRAd
‑
IL21
‑
IL23。
[0009]本专利技术溶瘤腺病毒CRAd
‑
IL21
‑
IL23的构建过程为：（1）首先构建穿梭 pGTE 质粒，用 pGTE 质粒中的 TERTp 替换了 E1 区的 E1A 启动子，修饰区域可以整合到 pShuttle
‑
CMV 载体中，然后整个重组载体可以转移回 pAdEasy
‑
1 骨架质粒基因组；（2）人IL23、人IL21、SV40pA、TERTp、E1A
‑
E1Bp、IRES和E1B55K编码序列通过PCR进行；（3）将PCR序列依次插入pGEM
‑
T easy质粒中，得到新的质粒PGEMTEZ
‑
IL21；（4）将人IL23序列依次插入 pShuttle
‑
CMV 的 Kpn I 和 Xho I 限制性位点以获得 pShuttle
‑
CMV
‑
IL23；（5）然后我们将PGEMTEZ
‑
IL21片段插入pShuttle
‑
CMV
‑
IL23的MfeI位点之间，并将新质粒命名为PSC
‑
IL21
‑
IL23；（6）将骨架质粒 (pAdEasy
‑
1) 电穿孔到 BJ5183 细胞中，然后将 PSC
‑r/>IL21
‑
IL23 电穿孔到 BJ5183
‑
pAdEasy
‑
1 细胞中；（7）通过卡那霉素抗性筛选转化的BJ5183细胞，并通过限制性消化确认重组；通过转染到 HEK
‑
293 细胞中产生重组质粒，并在细胞中扩增感染性病毒颗粒。
[0010]本专利技术所述溶瘤病毒以4
×
10
8 IFU用量包裹于水凝胶。
[0011]本专利技术水凝胶包裹溶瘤腺病毒CRAd
‑
IL21
‑
IL23的方法：（1）用PBS 制备Gtn
‑
HPA 溶液，浓度为5% w/v；（2）在 37
°
C 下孵育直至完全溶解，然后与CRAd
‑
IL21
‑
IL23和DCs混合得到含有 CRAd
‑
IL21
‑
IL23和DCs的 5% Gtn
‑
HPA/PBS 溶液；（3）分别与辣根过氧化物酶 (HRP) 和 H2O2混合；（4）将 HRP 添加到 CRAd
‑
IL21
‑
IL23/Gtn
‑
HPA 中并与 H2O2/Gtn
‑
HPA 混合；（5）在模具中吸取三到四次，20 分钟后将明胶转移到 12 孔板中，然后在明胶中加入 1 ml PBS。
[0012]本专利技术所述CRAd
‑
IL21
‑
IL23的浓度为4
×
10
8 IFU，DCs的细胞数量为1
×
106。
[0013]本专利技术的有益效果是：（1）本专利技术的靶向溶瘤疫苗为CRAd
‑
IL21
‑
IL23与DC细胞，装载CRAd通过受感染的肿瘤细胞共同表达IL21和IL23，改善免疫抑制的肿瘤微环境，促进DC细胞成熟，有效增加免疫效应细胞向肿瘤的运输，增强抗肿瘤免疫应答；（2）本专利技术将IL21和IL23组装在hTERT激活的溶瘤细胞CRAd中，通过病毒选择性杀死hTERT阳性癌细胞以及两个表达的抗癌基因之间的协同作用，靶向治疗原发性和继发性转移肿瘤，赋予了病毒额外的肿瘤选择性；（3）本专利技术的靶向溶瘤疫苗缓释水凝胶，可缓慢持续释放溶瘤CRAd
‑
IL21
‑
IL23与DC细胞，这依赖于明胶水凝胶基质的酶促和时间依赖性降解，CRAd
‑
IL21
‑
IL23与DC细胞更准确地定位在实体瘤组织中，并在很长时间内保持其生物活性，延长了药物的瘤内保留，并减少了其向周围非特异性健康组织的脱落，提高药物生物利用度，减轻毒副作用；（4）本专利技术的靶向溶瘤疫苗缓释水凝胶，水凝胶基质对抗病毒免疫的抑制作用有
助于增强病毒在肿瘤组织中的持久性，减少免疫系统对病毒的清除，延长CRAd+DCs/明胶系统的抗肿瘤作用。
附图说明
[0014]图1是载体PGEMTEZ
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IL21图；图2是载体pShuttle
‑
CMV
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IL23图；图3是载体pSC
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IL21
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IL23图；图4是CRAd
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IL21
‑
IL23构建图；图5是合成缓释载药Gtn
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HPA水凝胶；图6是水凝胶式缓释载体的靶向肿瘤疫苗；图7是水凝胶载体中CRAd的胶原酶浓度依赖性释放曲线图；图8是DC细胞从水凝胶系统中的持续释放曲线图；图9是联合载药水凝胶的小鼠模型体内抗肿瘤结果图。
具体实施方式
[0015]本专利技术选用DC细胞和装载治疗基因的溶瘤病毒作为靶向溶瘤疫苗，以水凝胶为缓释载体。
[0016]所述治疗基因包括（1）编码人端粒酶逆转录启动子（hTERT）的第一核酸片段；（2）编码人IL21细胞因子的第二核酸片段；（3）编码人IL23细胞因子的第三核酸片段；所述合成溶瘤病毒第一核酸片段序列如SEQIDNO:1所示；所述第二核酸片段序列如SEQIDNO:2所示；所述第三核酸片段序列如SEQIDNO:3所示；所述溶瘤病毒为溶瘤腺病毒；所述重组溶瘤病毒简称为CRAd
‑
IL21
‑
IL23。
[0017]本专利技术CRAd
‑
IL21
‑
IL23的构建过程为：（1）首先构建穿梭pGTE质粒，用pGTE质粒中的TERTp替换了E1区的E1A启动子，修饰区域可以整合到pShuttle
‑
CMV载体中，然后整个重组载体可以转移回pAdEasy
‑
1骨架质粒基因组。
[0018]（2）人IL23、人IL21、SV40pA、TERTp、E1A
‑
E1Bp、IRES和E1B55K编码序列通过PCR进行。
[0019]（3）将PCR序列依次插入pGEM
‑
Teasy质粒中，得到新的质粒PGEMTEZ
‑
IL21。
[0020]（4）将人IL23序列依次插入pShuttle
‑
CMV的KpnI和XhoI限制性位点以获得pShuttle
‑
CMV
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含有水凝胶式缓释载体的靶向肿瘤疫苗试剂盒，其特征在于：包括DC细胞、装载基因的溶瘤病毒作为靶向溶瘤疫苗、以水凝胶为缓释载体；其中装载基因包括
①
编码人端粒酶逆转录启动子的第一核酸片段SEQIDNO：1；
②
编码人IL21细胞因子的第二核酸片段SEQIDNO：2；
③
编码人IL23细胞因子的第三核酸片段SEQIDNO：3。2.根据权利要求1所述的含有水凝胶式缓释载体的靶向肿瘤疫苗试剂盒，其特征在于：所述溶瘤病毒为溶瘤腺病毒CRAd
‑
IL21
‑
IL23。3.根据权利要求2所述含有水凝胶式缓释载体的靶向肿瘤疫苗试剂盒，其特征在于：溶瘤腺病毒CRAd
‑
IL21
‑
IL23的构建过程为：（1）首先构建穿梭pGTE质粒，用pGTE质粒中的TERTp替换了E1区的E1A启动子，修饰区域可以整合到pShuttle
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CMV载体中，然后整个重组载体可以转移回pAdEasy
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1骨架质粒基因组；（2）人IL23、人IL21、SV40pA、TERTp、E1A
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E1Bp、IRES和E1B55K编码序列通过PCR进行；（3）将PCR序列依次插入pGEM
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Teasy质粒中，得到新的质粒PGEMTEZ
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IL21；（4）将人IL23序列依次插入pShuttle
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CMV的KpnI和XhoI限制性位点以获得pShuttle
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CMV
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IL23；（5）然后我们将PGEMTEZ
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IL21片段插入pShuttle
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CMV
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IL23的MfeI位点之间，并将新质粒命名为PSC
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IL21
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IL23；（6）将骨架质粒(pAd...

【专利技术属性】
技术研发人员：李扬，都雅楠，刘洋，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：