一种禽腺病毒血清4型mRNA疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种禽腺病毒血清4型mRNA疫苗及其制备方法和应用。该禽腺病毒血清4型mRNA疫苗包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明专利技术基于前期对FAdV

【技术实现步骤摘要】
一种禽腺病毒血清4型mRNA疫苗及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于mRNA疫苗制备
，具体涉及一种禽腺病毒血清4型mRNA疫苗及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]禽腺病毒血清4型(fowl adenovirus 4，FAdV
‑
4)引起鸡心包积液
‑
肝炎综合征(hydropericardium hepatitis syndrome，HHS)，1987年在巴基斯坦卡拉奇附近安卡拉地区首次报道该病，故又称安卡拉病(Angara Disease,AD)，该病主要以肝黄染、肿大和心包含有清亮透明的黄色液体等病理变化，我国多个省相继爆发并报道了FAdV
‑
4致高死亡率的疫情，并且在全球各国均有报道，严重影响了全球养禽业的健康发展。
[0003]目前还没有一款高效的商品化疫苗用于预防HHS，FAdV
‑
4的检出率在各养鸡场居高不下，mRNA疫苗与目前已有的DNA疫苗、亚单位疫苗、灭活疫苗的制备的方式和发挥作用的机理都不同，mRNA疫苗和DNA疫苗都属于核酸疫苗，但是mRNA疫苗大大减低了疫苗整合到宿主DNA的风险，mRNA疫苗的基本原理是通过特定的递送系统将表达抗原靶标的mRNA导入体内，在体内表达出蛋白并刺激机体产生特异性免疫学反应，从而使机体获得免疫保护，属于一种新型的基因工程苗。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种禽腺病毒血清4型mRNA疫苗及其制备方法和应用，本专利技术基于前期对FAdV
‑
4 Fiber2基因的生物学分析结果，通过基因工程技术构建重组体外转录质粒pGEM
‑
3Zf(+)
‑
Fiber2，并应用体外转录技术转录并修饰出成熟的mRNA分子，使用纳米脂质粒(LNPs)包裹后投递到动物体内。本专利技术选择Fiber2基因研制针对FAdV
‑
4的mRNA疫苗，可有效抵御高毒力FAdV
‑
4的感染，填补有效防控FAdV
‑
4疫苗的空缺。
[0005]为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0006]一种禽腺病毒血清4型mRNA疫苗，该禽腺病毒血清4型mRNA疫苗包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
[0007]进一步地，禽腺病毒血清4型mRNA疫苗包括与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列同源性大于80％，且编码具有相同功能蛋白的基因序列。
[0008]一种负载上述mRNA的脂质纳米粒。
[0009]一种含有上述mRNA的重组质粒。
[0010]上述mRNA疫苗、脂质纳米粒，或重组质粒在制备治疗禽腺病毒血清4型疾病的药物中的应用。
[0011]一种制备上述禽腺病毒血清4型mRNA疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0012](1)PCR扩增如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，再对扩增产物进行酶切纯化，然后将酶切纯化后的目的基因连接至载体上；
[0013](2)体外转录并纯化该目的基因，然后使其转染真核细胞表达，最后再与纳米脂质
体融合即可。
[0014]进一步地，PCR体系包括：2
×
Taq PCR Mix 25μL、模板DNA 4μL、引物F/R2μL，最后用ddH2O补充至50μL。
[0015]进一步地，PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性45s，61℃退火60s，72℃延伸60s，共35个循环；最后72℃延伸10min。
[0016]进一步地，引物F/R的具体序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。
[0017]进一步地，载体为pGEM
‑
3Zf(+)载体。
[0018]本专利技术的有益效果：
[0019]本专利技术基于前期对FAdV
‑
4 Fiber2基因的生物学分析结果，通过基因工程技术构建重组体外转录质粒pGEM
‑
3Zf(+)
‑
Fiber2，并应用体外转录技术转录并修饰出成熟的mRNA分子，使用纳米脂质粒(LNPs)包裹后投递到动物体内。本专利技术选择Fiber2基因研制针对FAdV
‑
4的mRNA疫苗，可有效抵御高毒力FAdV
‑
4的感染，填补有效防控FAdV
‑
4疫苗的空缺。
附图说明
[0020]图1为FAdV
‑
4 fiber2基因PCR扩增结果；
[0021]图2为体外转录系统示意图。
具体实施方式
[0022]下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本专利技术构思的专利技术创造均在保护之列。
[0023]实施例1 pGEM
‑
3Zf(+)Fiber2重组质粒的构建
[0024]1、引物设计
[0025]基于本实验室已测序的GZ
‑
QL株的Fiber2基因序列，并结合pGEM
‑
3Zf(+)载体的酶切位点，设计一对特异性引物。引物的序列及预扩增片段长度见表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0026]表1引物序列
[0027][0028][0029]2、目的基因的扩增
[0030]通过PCR方法得到FAdV
‑
4GZ
‑
QL株Fiber2全基因片段，建立50μL反应体系：
[0031]表2 PCR体系
[0032][0033]混合均匀后，按下列反应条件进行目的基因PCR扩增：95℃5min；95℃45s，61℃60s，72℃60s，共35个循环；72℃延伸10min。取7μL PCR产物应用含Gold View核酸染料的1.2％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果(图1，其中，M为2000Marker；条带1～4为FAdV
‑
4 Fiber2基因扩增产物；条带
‑
为空白对照)。
[0034]3、FAdV
‑
4 Fiber2基因双酶切
[0035]应用限制性内切酶ClaⅠ和KpnⅠ对目的基因FAdV
‑
4 Fiber2 PCR产物进行双酶切，50μL双酶切体系：
[0036]表3双酶切体系
[0037][0038]37℃酶切5h，应用胶回收试剂盒对双酶切产物进行目的基因的纯化回收，
‑
20℃冰箱保存备用。
[0039]4、pGEM
‑
3Zf(+)载体双酶切
[0040]应用限制性内切酶Cl本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种禽腺病毒血清4型mRNA疫苗，其特征在于，所述禽腺病毒血清4型mRNA疫苗包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的禽腺病毒血清4型mRNA疫苗，其特征在于，所述禽腺病毒血清4型mRNA疫苗包括与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列同源性大于80％，且编码具有相同功能蛋白的基因序列。3.一种负载权利要求1或2所述mRNA的脂质纳米粒。4.一种含有权利要求1或2所述mRNA的重组质粒。5.权利要求1或2所述的mRNA疫苗、权利要求3所述的脂质纳米粒，或权利要求4所述重组质粒在制备治疗禽腺病毒血清4型疾病的药物中的应用。6.一种制备权利要求1所述禽腺病毒血清4型mRNA疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)PCR扩增如SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：程振涛，方天，尹德晶，岳筠，文明，朱二鹏，冯孝傲，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：