一种禽腺病毒亚单位疫苗的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种禽腺病毒亚单位疫苗的制备方法及应用，将益生菌胞外多糖水溶液、禽腺病毒4型fiber 2重组蛋白水溶液、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯水溶液混合均匀，匀速滴加到容器中，在容器中搅拌反应0.5～2h，得到重组蛋白共递送疫苗。本发明专利技术通过优化条件使表达蛋白的可溶性大大提高，提高蛋白产量，增强蛋白免疫原性，配伍益生菌胞外多糖佐剂，以维生素E聚乙二醇琥珀酸酯为载体制备的重组蛋白共递送疫苗比普通亚单位疫苗免疫效果更好，更小的剂量即可成功预防禽腺病毒的感染，使免疫鸡群得到有效保护。有效保护。有效保护。

【技术实现步骤摘要】
一种禽腺病毒亚单位疫苗的制备方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及到一种禽腺病毒亚单位疫苗的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]禽腺病毒是腺病毒科、禽腺病毒属的成员，主要感染的禽类除了常见的家禽，如，鸡、鸭、鹅之外也感染野生动物，如鹌鹑、火鸡等。根据病毒抗原结构的不同，禽腺病毒属可分为三个亚群(Ⅰ～Ⅲ)，根据血清交叉中和试验和基因组分析可以将Ⅰ群禽腺病毒分为5个种(FAdV A～FAdV E)和12个血清型(FAdV 1～7，8a，8b，9～11)。在12个血清型中，FAdV
‑
2、8a、8b和11血清型普遍引起包涵体肝炎(inclusionbody hepatitis,IBH)，而FAdV
‑
4则是引起禽类发生心包积液
‑
肝炎综合征(hydropericardium
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hepatitis syndrome,HHS)的主要病原体。Ⅰ群禽腺病毒通常感染3～5周龄肉鸡以及5～11周龄蛋鸡，病程一般为5～7天，感染后3～5天达到死亡高峰。近年来在我国范围内主要流行的病原体是FAdV
‑
4、FAdV
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8a、FAdV
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8b，间或感染FAdV
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2。其中FAdV
‑
4仍是最主要流行毒株。腺病毒常与其他禽类病毒混合感染。
[0003]血清4型禽腺病毒粒子呈二十面体中心对称，直径70
‑
90nm，无囊膜，主要由六邻体蛋白(hexon)、纤突蛋白(fiber 1、fiber 2)、五邻体蛋白(penton)组成。现有禽腺病毒疫苗多是使用灭活的病原体作为抗原，存在灭活不完全及携带其他病原体的危险，而且疫苗生产成本高，很难作为商品化疫苗发展。为解决这些问题，急需开发新型亚单位疫苗。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种重组血清4型禽腺病毒fiber2蛋白，配伍一种益生菌胞外多糖作为佐剂，以维生素E聚乙二醇琥珀酸酯为载体，制备重组蛋白共递送疫苗系统，有效防控高致病性禽腺病毒的感染。
[0005]为实现本专利技术的目的采用如下技术方案：
[0006]本专利技术提供一种禽腺病毒亚单位疫苗的制备方法，其由以下步骤组成，将益生菌胞外多糖水溶液、禽腺病毒4型fiber 2重组蛋白水溶液、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯水溶液混合均匀，按照0.5～4ml/min的速度匀速滴加到容器中，在容器中搅拌反应0.5～2h，得到重组蛋白共递送疫苗；所述益生菌胞外多糖、禽腺病毒4型fiber 2重组蛋白、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯的质量比为1～2：1：1～2；所述禽腺病毒为血清4型禽腺病毒，所述禽腺病毒亚单位疫苗的抗原为血清4型禽腺病毒fiber2蛋白。
[0007]优选地，所述益生菌胞外多糖水溶液，其浓度为0.5～0.6mg/ml。
[0008]优选地，所述禽腺病毒4型fiber 2重组蛋白水溶液，其浓度为0.2～0.3mg/ml。
[0009]优选地，所述维生素E聚乙二醇琥珀酸酯水溶液，其浓度为0.5～0.6mg/ml。
[0010]优选地，按照1～3ml/min的速度匀速滴加到容器中。
[0011]优选地，以搅拌速度300～400rpm/min，25℃反应30min。
[0012]所述禽腺病毒4型fiber 2重组蛋白，其制备方法为，构建fiber 2蛋白原核表达质粒，将质粒转化入BL21感受态菌株，诱导表达重组蛋白并纯化。
[0013]本专利技术还提供所述的禽腺病毒亚单位疫苗的应用，所述禽腺病毒亚单位疫苗用于制备禽腺病毒免疫疫苗或制备禽腺病毒检测试剂盒。
[0014]本专利技术提供的可快速检测4型禽腺病毒抗体的ELISA检测方法，包括：包被抗原、抗原包被液、封闭液、样品稀释液、显色液、二抗、洗涤液、终止液、阴性标准品、阳性标准品。
[0015]进一步的，所述包被抗原为原核表达的fiber 2蛋白。
[0016]进一步的，包被液为碳酸盐缓冲液，pH9.6。
[0017]进一步的，样品稀释液为含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液，pH7.4。
[0018]进一步的，所述二抗为山羊抗鸡IgG酶标二抗。
[0019]进一步的，所述终止液为2M的H2SO4溶液。
[0020]进一步的，所述洗涤液为0.05％PBST，pH7.4。
[0021]本专利技术有益效果：
[0022]本专利技术构建的fiber 2蛋白原核表达载体，通过优化条件使表达蛋白的可溶性大大提高，提高蛋白产量，增强蛋白免疫原性，配伍益生菌胞外多糖佐剂，以维生素E聚乙二醇琥珀酸酯为载体制备的重组蛋白共递送疫苗比普通亚单位疫苗免疫效果更好，更小的剂量即可成功预防禽腺病毒的感染，使免疫鸡群得到有效保护。
[0023]本专利技术制备的重组蛋白共递送疫苗，以维生素E聚乙二醇琥珀酸酯为载体，其吸附益生菌胞外多糖及fiber2抗原，通过自组装反应使得多糖及fiber 2抗原形成有序结构，实现疫苗靶向作用，促进疫苗的吸收，更大限度发挥胞外多糖及抗原的免疫作用，提高疫苗的效果。
附图说明
[0024]图1为实施例1中鉴定禽腺病毒的PCR扩增结果图
[0025]图2为实施例4中fiber 2基因的PCR扩增图
[0026]图3为实施例4中fiber 2蛋白的诱导表达图
[0027]图4为实施例4中fiber 2蛋白的纯化图
具体实施方式
[0028]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。
[0029]实施例1：
[0030]4型禽腺病毒JS株的分离与鉴定
[0031]1.1病毒的分离
[0032]病料采集于江苏省某疑似FAdV
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4感染的鸡场。主要采集发病鸡肝脏组织，
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80℃保存。取适量肝脏组织放入2mL离心管中，加入800μL左右无菌PBS和3～5粒无菌小钢珠。提前30min预冷研磨仪样品放置盒，研磨20min。12000r/min，4℃离心10min，吸取上清至无菌离心管中，加入10U/mL双抗溶液，混匀接种9～11日龄鸡胚，每个样品重复接种两枚，每枚接种0.1～0.2mL。石蜡封口后，写上标记放于37℃温箱中培养48～72h，每间隔12h观察一次，剔
除24h内死亡的鸡胚。收集24h之后死亡鸡胚，放于4℃等待鉴定；72h后，取出所有鸡胚，4℃冷冻过夜后，收取尿囊液进行鉴定。
[0033]1.2病毒的鉴定
[0034]根据4型禽腺病毒的hexon基因设计引物，通过PCR扩增对分离获得的毒株进行鉴定。具体操作如下：
[0035]取尿囊液200μL，按照病毒基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，将所得到的DNA溶液置于
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20℃保存或用于后续试验。设计合成鉴定引物：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种禽腺病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：由以下步骤组成，将益生菌胞外多糖水溶液、禽腺病毒4型fiber 2重组蛋白水溶液、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯水溶液混合均匀，按照0.5～4ml/min的速度匀速滴加到容器中，在容器中搅拌反应0.5～2h，得到重组蛋白共递送疫苗；所述益生菌胞外多糖、禽腺病毒4型fiber 2重组蛋白、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯的质量比为1～2：1：1～2；所述禽腺病毒为血清4型禽腺病毒，所述禽腺病毒亚单位疫苗的抗原为血清4型禽腺病毒fiber2蛋白。2.根据权利要求1所述的禽腺病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：所述益生菌胞外多糖水溶液，其浓度为0.5～0.6mg/ml。3.根据权利要求1或2所述的禽腺病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：所述禽腺病毒4型fiber 2重组蛋白水溶液，其浓度为0.2～0.3mg/ml。4.根据权利要求1或2所述的禽腺病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：所述维生素E聚乙二醇琥珀酸酯水溶液，其浓度为0.5～0.6mg/ml。5.根据权利要求1或2所述的禽腺病毒亚单位疫苗的制备方...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫丽萍，宋素泉，刘萌，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：