一种产(-)-α-红没药醇的重组基因工程菌及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种产(

【技术实现步骤摘要】
NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列代替，并与无起始密码子ATG的法尼基二磷酸合酶ispA基因连接。
[0007]进一步地，所述(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶MrBBS基因5
’
端带有核苷酸序列SEQ ID NO.1。
[0008]更进一步地，所述(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶MrBBS基因来自春黄菊花；所述法尼基二磷酸合酶ispA基因来自大肠杆菌。
[0009]更进一步地，所述(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶MrBBS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述法尼基二磷酸合酶ispA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
[0010]更进一步地，所述(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶MrBBS基因与法尼基二磷酸合酶ispA基因连接后的核苷酸序列如SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55或SEQ ID NO.56所示。
[0011]进一步地，所述MVA途径基因包括甲羟戊酸激酶mvaKmm基因、甲羟戊酸5
‑
焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因、异戊烯基二磷酸δ
‑
异构酶idi基因、3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因、乙酰乙酰CoA硫解酶/3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰CoA还原酶mvaE基因和/或甲羟戊酸激酶mvaK1基因。
[0012]更进一步地，所述甲羟戊酸激酶mvaKmm基因来自甲烷八叠球古菌Methanosarcina mazei；
[0013]所述甲羟戊酸5
‑
焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因和甲羟戊酸激酶mvaK1基因来自肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae；
[0014]所述异戊烯二磷酸δ异构酶idi基因来自大肠杆菌Escherichia coli；
[0015]所述3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因和乙酰乙酰CoA硫解酶/3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰CoA还原酶mvaE基因来自粪肠球菌Enterococcus faecalis。
[0016]更进一步地，所述甲羟戊酸激酶mvaKmm基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，甲羟戊酸5
‑
焦磷酸脱羧酶mvaD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，异戊烯二磷酸δ异构酶idi基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，乙酰乙酰CoA硫解酶/3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰CoA还原酶mvaE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，甲羟戊酸激酶mvaK1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
[0017]更进一步地，所述异戊烯基二磷酸δ
‑
异构酶idi基因5
’
端带有核苷酸序列SEQ ID NO.3，乙酰乙酰CoA硫解酶/3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰CoA还原酶mvaE基因5
’
端带有核苷酸序列SEQ ID NO.4，3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因5
’
端带有核苷酸序列SEQ ID NO.5，甲羟戊酸激酶mvaKmm基因5
’
端带有核苷酸序列SEQ ID NO.6。
[0018]更进一步地，所述MVA途径基因与(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶MrBBS基因和法尼基二磷酸合酶ispA基因连接在两个质粒上，其中一个质粒连接的核苷酸序列包括SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55或SEQ ID NO.56，以及SEQ ID NO.50，另一个质粒连接的核苷酸序列包括SEQ ID NO.51。
[0019]更进一步地，所述质粒优选为质粒pSTV28和质粒pTrc99A。
[0020]进一步地，所述重组大肠杆菌为重组大肠杆菌E.coli DH5α或E.coli W3110。
[0021]本专利技术还提供了一种前述重组基因工程菌的制备方法，它包括如下步骤：
[0022]1)取(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶MrBBS基因和法尼基二磷酸合酶ispA基因融合，融合产物与线性化表达载体连接，再导入大肠杆菌，提取重组表达载体；
[0023]所述(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶MrBBS基因中的终止密码子TAA被如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列代替；
[0024]所述法尼基二磷酸合酶ispA基因中的起始密码子ATG被如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列代替；
[0025]2)取MVA途径基因融合，融合产物与酶切后的步骤1)所得重组表达载体连接，再导入大肠杆菌，提取重组表达载体；
[0026]3)取甲羟戊酸激酶mvaK1基因，与包含甲羟戊酸5
‑
焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因和异戊烯基二磷酸δ
‑
异构酶idi基因的基因片段融合，融合产物与线性化表达载体连接，再导入大肠杆菌，提取重组表达载体；
[0027]4)将步骤2)所得重组表达载体和步骤3)所得重组表达载体，导入大肠杆菌中，即得重组基因工程菌。
[0028]进一步地，步骤1)所述表达载体为质粒pSTV28。
[0029]进一步地，步骤2)所述取MVA途径基因融合是取包含甲羟戊酸激酶mvaKmm基因、甲羟戊酸5
‑
焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因和异戊烯基二磷酸δ
‑
异构酶idi基因的基因片段，与包含3
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇的重组基因工程菌，其特征在于：它是包含(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶MrBBS基因、法尼基二磷酸合酶ispA基因、MVA途径基因的重组大肠杆菌；所述(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶MrBBS基因与法尼基二磷酸合酶ispA基因之间通过SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列连接。2.根据权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶MrBBS基因中的终止密码子TAA被SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列代替，并与无起始密码子ATG的法尼基二磷酸合酶ispA基因连接。3.根据权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶MrBBS基因5
’
端带有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶MrBBS基因来自春黄菊花；所述法尼基二磷酸合酶ispA基因来自大肠杆菌。5.根据权利要求4所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述(
‑
)
‑
α
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红没药醇合成酶MrBBS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述法尼基二磷酸合酶ispA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。6.根据权利要求5所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶MrBBS基因与法尼基二磷酸合酶ispA基因连接后的核苷酸序列如SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55或SEQ ID NO.56所示。7.根据权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述MVA途径基因包括甲羟戊酸激酶mvaKmm基因、甲羟戊酸5
‑
焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因、异戊烯基二磷酸δ
‑
异构酶idi基因、3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因、乙酰乙酰CoA硫解酶/3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰CoA还原酶mvaE基因和/或甲羟戊酸激酶mvaK1基因。8.根据权利要求7所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述甲羟戊酸激酶mvaKmm基因来自甲烷八叠球古菌Methanosarcina mazei；所述甲羟戊酸5
‑
焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因和甲羟戊酸激酶mvaK1基因来自肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae；所述异戊烯二磷酸δ异构酶idi基因来自大肠杆菌Escherichia coli；所述3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因和乙酰乙酰CoA硫解酶/3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰CoA还原酶mvaE基因来自粪肠球菌Enterococcus faecalis。9.根据权利要求8所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述甲羟戊酸激酶mvaKmm基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，甲羟戊酸5
‑
焦磷酸脱羧酶mvaD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，异戊烯二磷酸δ异构酶idi基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰CoA合酶mvaS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，乙酰乙酰CoA硫解酶/3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰CoA还原酶mvaE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，甲羟戊酸激酶mvaK1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。10.根据权利要求9所述的重组基因工程菌：其特征在于：所述异戊烯基二磷酸δ
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异构酶idi基因5
’
端带有核苷酸序列SEQ ID NO.3，乙酰乙酰CoA硫解酶/3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰CoA还原酶mvaE基因5
’
端带有核苷酸序列SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛巧利，厉晓波，童丽珍，赵华，
申请(专利权)人：上海锐康生物技术研发有限公司，
类型：发明
国别省市：