重组菌株及其在利用甲酸或其衍生物中的应用和方法技术

本发明专利技术公开了重组菌株及其在利用甲酸或其衍生物中的应用和方法，属于生物技术和工程领域，主要通过对大肠杆菌(Escherichia coli)的基因工程化改造，使其能同化甲酸或甲酸盐，即能够以甲酸或甲酸盐为碳源进行生长代谢。本发明专利技术所使用的基因工程化大肠杆菌包含来自多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)的甲醛脱氢酶(BmFaldDH)、来自鞭毛甲基小杆菌(Methylobacillus flagellatus)的3

【技术实现步骤摘要】
重组菌株及其在利用甲酸或其衍生物中的应用和方法


[0001]本专利技术属于生物技术和工程
，具体涉及重组大肠杆菌。

技术介绍

[0002]近年来，由于全球能源危机、粮食危机与糖价波动等多重因素叠加，以葡萄糖为单一或重要碳源的生物发酵产业受到严重冲击。与此同时，二氧化碳、甲烷、甲醛、甲醇和甲酸盐等一碳资源以其量大价廉的优势，逐渐成为代谢工程中被青睐的新型碳源。甲酸和甲酸盐是很有前途的一碳物质，可用于生物合成各种高附加值的化学品。天然的甲酸营养微生物能够将甲酸盐转化为生物量或生物质，但由于天然甲酸营养微生物的基因难以改造，或由于其生物量和合成代谢产物产量较低，在其生物合成过程中以甲酸盐作为碳源会受到较多限制。因此，改造一种具有较高生长率、易于进行甲酸盐代谢的工业微生物至关重要。天然的大肠杆菌通过甲酸脱氢酶将甲酸和甲酸盐不可逆地转化为二氧化碳，但同时甲醛和甲醇是单碳代谢的一个循环中心，可通过丝氨酸循环、还原性辅酶A循环、核酮糖单磷酸循环等多个途径将甲酸、甲酸盐引入中心代谢途径，这为利用基因工程手段对大肠杆菌的合成代谢途径进行遗传修饰和改造，使甲酸可以被大肠杆菌中用于生物合成提供了理论依据。近年来，很多专家学者已经在大肠杆菌中进行了相关基因的改造，以增加其甲酸盐固定能力。但目前的研究结果还存在着改造菌株对甲酸或甲酸盐的利用率低、速度慢等问题，有必要进行进一步的改进。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了重组菌株及其在利用甲酸或其衍生物中的应用和方法。本专利技术提供了一种基因重组的大肠杆菌，该工程菌可高效利用具有细胞毒性的甲酸或甲酸盐作为碳源进行生产代谢及生产目的产物。
[0004]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
[0005]一种能够利用甲酸或其衍生物的重组菌株，所述重组菌株为转入了如SEQ ID No.9所示的BmFaldDH基因和如SEQ ID No.10所示的HPS+PHI基因的大肠杆菌E.coli MG1655。
[0006]本专利技术的重组菌株包含来自多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)的甲醛脱氢酶(BmFaldDH)、来自鞭毛甲基小杆菌(Methylobacillus flagellatus)的3
‑
己酮糖
‑6‑
磷酸合酶(HPS)和来自鞭毛甲基小杆菌(Methylobacillus flagellatus)的6
‑
磷酸
‑3‑
己酮糖异构酶(PHI)。通过在E.coli胞内过表达这三种基因实现强化核酮糖单磷酸(RuMP)循环，从而达到甲酸或其衍生物同化的目的。
[0007]进一步地，所述重组菌株通过以下方法制备得到：
[0008]1)将所述如SEQ ID No.9所示的BmFaldDH基因与pTrc99a质粒连接、转化，得到质粒pTrc99a
‑
BmFaldDH；
[0009]2)将所述如SEQ ID No.10所示的HPS+PHI基因与步骤1)得到的质粒pTrc99a
‑
BmFaldDH连接、转化，得到质粒pTrc99a
‑
BmFaldDH
‑
HPS+PHI；
[0010]3)将步骤2)得到的质粒pTrc99a
‑
BmFaldDH
‑
HPS+PHI转化进大肠杆菌E.coli MG1655，得到所述重组菌株。
[0011]优选地，所述步骤1)中，采用如SEQ ID No.1所示的引物BmFaldDH
–
F和如SEQ ID No.2所示的引物BmFaldDH
‑
R扩增得到所述BmFaldDH基因，用于与所述pTrc99a质粒连接、转化，得到所述质粒pTrc99a
‑
BmFaldDH。
[0012]优选地，所述步骤1)中，采用如SEQ ID No.3所示的引物pTrc99A
‑
F和如SEQ ID No.4所示的引物pTrc99A
‑
R扩增得到所述pTrc99a质粒，用于与所述BmFaldDH基因连接、转化，得到所述质粒pTrc99a
‑
BmFaldDH。
[0013]优选地，所述步骤2)中，采用如SEQ ID No.5所示的引物HPS+PHI
‑
F和如SEQ ID No.6所示的引物HPS+PHI
‑
R扩增得到所述HPS+PHI基因，用于与所述质粒pTrc99a
‑
BmFaldDH连接、转化，得到所述质粒pTrc99a
‑
BmFaldDH
‑
HPS+PHI。
[0014]优选地，所述步骤2)中，采用如SEQ ID No.7所示的引物pTrc99A
‑
F
‑
1和如SEQ ID No.8所示的引物pTrc99A
‑
R
‑
1扩增得到所述pTrc99a
‑
BmFaldDH质粒，用于与所述HPS+PHI基因连接、转化，得到所述质粒pTrc99a
‑
BmFaldDH
‑
HPS+PHI。
[0015]优选地，所述步骤3)中，采用热激转化法将所述质粒pTrc99a
‑
BmFaldDH
‑
HPS+PHI转化进所述大肠杆菌E.coli MG1655。
[0016]优选地，以Gibson无缝连接的方式进行所述BmFaldDH基因与所述pTrc99a质粒的连接。
[0017]优选地，以Gibson无缝连接的方式进行所述HPS+PHI基因与所述质粒pTrc99a
‑
BmFaldDH的连接。
[0018]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
[0019]一种上述的重组菌株在利用甲酸或其衍生物中的应用。
[0020]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
[0021]一种利用上述的重组菌株同化甲酸或其衍生物的方法，将所述重组菌株接种于含有氨苄青霉素抗性LB培养基中，在36～38℃进行多级扩大培养得到菌液，加入诱导剂并在28～32℃进行诱导培养，随后与甲酸或其衍生物混合，所述重组菌株以甲酸或其衍生物为碳源进行生长代谢，实现对甲酸或其衍生物的同化。
[0022]本专利技术所述的利用甲酸或其衍生物，指的是该重组菌株能同化甲酸或其衍生物，即能够以甲酸或其衍生物为碳源进行生长代谢。具体地，所述重组菌株在利用甲酸或其衍生物中的应用例如为分解甲酸或其衍生物，或者利用甲酸或其衍生物制备甲醇、乙醇、甲醛、甘氨酸、丝氨酸、丙酮酸等物质，但并不以此为限。
[0023]具体地，本专利技术所述的甲酸的衍生物为甲酸盐。
[0024]本专利技术的一个优选的实施例示例如下：
[0025]1.构建p本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种能够利用甲酸或其衍生物的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株为转入了如SEQ ID No.9所示的BmFaldDH基因和如SEQ ID No.10所示的HPS+PHI基因的大肠杆菌E.coli MG1655。2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株通过以下方法制备得到：1)将所述如SEQ ID No.9所示的BmFaldDH基因与pTrc99a质粒连接、转化，得到质粒pTrc99a
‑
BmFaldDH；2)将所述如SEQ ID No.10所示的HPS+PHI基因与步骤1)得到的质粒pTrc99a
‑
BmFaldDH连接、转化，得到质粒pTrc99a
‑
BmFaldDH
‑
HPS+PHI；3)将步骤2)得到的质粒pTrc99a
‑
BmFaldDH
‑
HPS+PHI转化进大肠杆菌E.coli MG1655，得到所述重组菌株。3.根据权利要求2所述的重组菌株，其特征在于：所述步骤1)中，采用如SEQ ID No.1所示的引物BmFaldDH
–
F和如SEQ ID No.2所示的引物BmFaldDH
‑
R扩增得到所述BmFaldDH基因，用于与所述pTrc99a质粒连接、转化，得到所述质粒pTrc99a
‑
BmFaldDH。4.根据权利要求2所述的重组菌株，其特征在于：所述步骤1)中，采用如SEQ ID No.3所示的引物pTrc99A
‑
F和如SEQ ID No.4所示的引物pTrc99A
‑
R扩增得到所述pTrc99a质粒，用于与所述BmFaldDH基因连接、转化，得到所述质粒pTrc99a
‑
BmFaldDH。5.根据权利要求2所述的重组菌株，其特征在于：所述步骤2)中，采用如SEQ ID No.5所示的引物HPS+PHI

【专利技术属性】
技术研发人员：祁峰，黄建忠，晋豆，顾苏宜，苏愉，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：