一种Kabuki综合征类脑器官模型的制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及一种Kabuki综合征类脑器官模型的制备方法及其应用。本发明专利技术提供了GSK

【技术实现步骤摘要】
一种Kabuki综合征类脑器官模型的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及一种Kabuki综合征类脑器官模型的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]Kabuki综合征是一种罕见显性遗传疾病，以先天性多系统发育缺陷为特征。该病症患者有不同程度的神经发育迟缓和智力残疾。然而该疾病缺乏治疗手段，疾病分子机制也不明确。其中一型Kabuki综合征(KS1)约占70％，由KMT2D突变所导致。KMT2D属于组蛋白甲基转移酶家族，通过SET结构域进行组蛋白H3在赖氨酸4上的甲基化(H3K4me)。目前已有的Kabuki模型包括杂合小鼠、斑马鱼、以及2D人类细胞模型。然而，人类大脑发育的复杂性非动物模型与单一的2D细胞模型可比拟。

技术实现思路

[0003]一些实施方案中，本专利技术提供了GSK
‑
3抑制剂在制备治疗Kabuki综合征药物中的应用。
[0004]一些实施方案中，所述的药物包含有效量的GSK
‑
3抑制剂。
[0005]一些实施方案中，所述药物还包括药学上可接受的药用载体。
[0006]一些实施方案中，所述药用载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂和润滑剂中的一种或几种。
[0007]一些实施方案中，本专利技术提供了一种GSK
‑
3抑制剂在制备回复GABA能神经元的药物中的应用。
[0008]一些实施方案中，所述回复GABA能神经元是回复Kabuki综合征患者的GABA能神经元。
[0009]一些实施方案中，所述GSK
‑
3抑制剂包括chir99021。
[0010]一些实施方案中，所述的Chir99021的结构式如式1所示：
[0011][0012]一些实施方案中，所述GSK
‑
3抑制剂通过回复GABA能神经元治疗Kabuki综合征。
[0013]一些实施方案中，所述Kabuki综合征为KMT2D突变所导致的Kabuki综合征。
[0014]一些实施方案中，所述Kabuki综合征为KMT2D缺失的Kabuki综合征。一些实施方案中，专利技术人研究过程中发现了所述chir99021能够达到优选的剂量。
[0015]一些实施方案中，本专利技术提供了载体，所述载体包含：(1)与待改变的转化区5
’
端同源的DNA片段，即5
’
臂，其选自KMT2D基因功能结构域SET区域上游1499bp同源序列；(2)与待改变的转换区3
’
端同源的第二个DNA片段，即3
’
臂，其选自KMT2D基因功能结构域SET区域下游1657bp同源序列。
[0016]一些实施方案中，所述5
’
臂尾端接了TAGTAATGA终止密码子终止转录。
[0017]一些实施方案中，所述5
’
臂和3
’
臂之间还含有PGK
‑
Puro或PGK
‑
Hygro抗性筛选标志。
[0018]一些实施方案中，所述5
’
臂的序列如SEQ ID NO:11所示。
[0019]一些实施方案中，所述3
’
臂的序列如SEQ ID NO:12所示。
[0020]一些实施方案中，含有PGK
‑
Puro的载体的序列如SEQ ID NO:21所示。
[0021]一些实施方案中，含有PGK
‑
Hygro的靶向载体的序列如SEQ ID NO:22所示。
[0022]一些实施方案中，所述载体用于敲除KMT2D。
[0023]一些实施方案中，所述载体用于对KMT2D
‑
SET区域进行敲除。
[0024]一些实施方案中，所述载体为靶向载体。
[0025]一些实施方案中，本专利技术提供了所述的载体在敲除KMT2D基因中的应用。
[0026]一些实施方案中，本专利技术提供了一种细胞，所述细胞包含所述的靶向载体。
[0027]一些实施方案中，本专利技术提供了所述的细胞在制备大脑的类器官中的应用。
[0028]一些实施方案中，所述大脑类器官为Kabuki综合征的大脑的类器官。
[0029]一些实施方案中，所述大脑的类器官为哺乳动物的大脑类器官。
[0030]一些实施方案中，所述哺乳动物为人。
[0031]一些实施方案中，所述方法包括在胚胎干细胞中，通过靶向载体同源重组，用两种不同的筛选标志，分别替换双等位KMT2D，进行双等位KMT2D的敲除。
[0032]一些实施方案中，所述靶向载体为上述所述的靶向载体。
[0033]一些实施方案中，所述两种不同的筛选标志为PGK
‑
Puro和PGK
‑
Hygro抗性筛选标志。
[0034]一些实施方案中，所述的大脑的类器官为Kabuki综合征的大脑的类器官。
[0035]一些实施方案中，所述的大脑的类器官为哺乳动物的大脑类器官。
[0036]一些实施方案中，所述所述哺乳动物为人。
[0037]目前已有的Kabuki模型包括杂合小鼠、斑马鱼、以及2D人类细胞模型。然而，人类大脑发育的复杂性非动物模型与单一的2D细胞模型可比拟。本专利技术中，专利技术人利用CRISPR
‑
CAS9基因编辑技术敲除KMT2D，使用类脑器官技术建立了Kabuki综合征类脑器官模型。研究发现，与野生型相比，Kabuki综合征类脑器官出现提前过量GABA能神经元的分化。而通过测试小分子chir99021加入剂量与时间窗口，我们发现该小分子可以回复Kabuki综合征类脑器官中神经元异常分化的表型。该发现将为Kabuki综合征的治疗提供新思路。
[0038]一些实施方案中，所述双等位KMT2D结构域被替换。
[0039]一些实施方案中，所述结构域为外显子51至54之间区域。
[0040]一些实施方案中，所述敲除还使用了sgRNA。
[0041]一些实施方案中，所述sgRNA靶向的基因为KMT2D基因。
[0042]一些实施方案中，所述sgRNA靶向KMT2D
‑
SET区域。
[0043]一些实施方案中，所述sgRNA包括如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的sgRNA。
[0044]一些实施方案中，本专利技术提供了所述的方法制备得到的大脑的类器官。
[0045]一些实施方案中，所述的大脑的类器官为哺乳动物的大脑类器官。
[0046]一些实施方案中，所述所述哺乳动物为人。
[0047]一些实施方案中，所述的大脑的类器官中的GABA能神经元的过量表达。
[0048]一些实施方案中，本专利技术提供了所述的大脑的类器官在药物发现筛选、毒性测定、脑部或神经疾病的药物或基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.GSK
‑
3抑制剂在制备治疗Kabuki综合征药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GSK
‑
3抑制剂包括Chir99021；优选地，所述的Chir99021的结构式如式1所示：优选地，所述Kabuki综合征为KMT2D突变所导致的Kabuki综合征；优选地，所述Kabuki综合征为KMT2D缺失的Kabuki综合征；优选地，所述的药物包含有效量的GSK
‑
3抑制剂；优选地，所述药物还包括药学上可接受的药用载体；更为优选地，所述药用载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂和润滑剂中的一种或几种。3.GSK
‑
3抑制剂在制备回复GABA能神经元的药物中的应用；优选地，回复Kabuki综合征患者的GABA能神经元；优选地，所述GSK
‑
3抑制剂包括chir99021；优选地，所述Kabuki综合征为KMT2D基因突变所导致的Kabuki综合征；优选地，所述Kabuki综合征为KMT2D基因缺失的Kabuki综合征。4.一种载体，其特征在于，所述载体包含：(1)与待改变的转化区5
’
端同源的DNA片段，即5
’
臂，其选自KMT2D基因功能结构域SET区域上游1499bp同源序列；(2)与待改变的转换区3
’
端同源的第二个DNA片段，即3
’
臂，其选自KMT2D基因功能结构域SET区域下游1657bp同源序列。优选地，所述5
’
臂尾端接了TAGTAATGA终止密码子终止转录；优选地，所述5
’
臂和3
’
臂之间还含有PGK
‑
Puro或PGK
‑
Hygro抗性筛选标志；优选地，所述5
’
臂的序列如SEQ ID NO:11所示；优选地，所述3
’
臂的序列如SEQ ID NO:12所示；优选地，含有PGK
‑
Puro的载体的序列如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：‑，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：