一种基于靶控选择杂交链式反应的检测双真菌毒素的方法。本发明专利技术提供了一种用于多种真菌毒素荧光检测的靶控选择杂交链式反应。赭曲霉毒素A(OTA)和黄曲霉毒素B1(AFB1)可以与金纳米粒子上的特定适配子结合，导致短DNA触发序列的释放。短DNA触发序列可以触发杂交链式反应的不同反应路线，从而产生两种侧链序列。侧链序列可以导致DNA镊子打开，从而恢复荧光信号。赭曲霉毒素A的线性检测范围为0.06至2ng/mL,R2＝0.994，黄曲霉毒素B1的线性检测范围为0.005至1ng/mL,R2＝0.992，赭曲霉毒素A的检测限为0.02ng/mL，黄曲霉毒素B1的检测限为0.002ng/mL。更重要的是，它在实际食品样品分析中显示出极高的灵敏度和选择性，可同时检测赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1。赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1。赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1。
【技术实现步骤摘要】
一种基于靶控选择杂交链式反应的检测双真菌毒素的方法
[0001]本专利技术涉及一种双真菌毒素的检测领域，特别是基于靶控选择杂交链式反应和荧光的双真菌毒素检测方法领域。
技术介绍
[0002]几种慢性病与接触污染食品中的一种或多种真菌毒素有关，包括胃肠道或肾脏疾病，以及免疫抑制。此外，一些真菌毒素已被国际癌症研究机构(IARC)列为致癌物。一些调查表明，联合摄入真菌毒素可能比仅摄入其中一种真菌毒素会导致更高的毒性和损害。例如，大多数与赭曲霉毒素A的真菌毒素混合物表现出加性或协同效应，表明这些组合可能会产生更强的毒性效应。在过去几年中，多种真菌毒素对健康的威胁引起了人们对不同毒素共存及其协同毒性效应的担忧。已经做出了许多努力来开发检测食品和饲料中真菌毒素的分析方法，包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、高效液相色谱(HPLC)和液相色谱与质谱联用(LC/MS)、电化学、比色法。尽管传统技术提供了高灵敏度、准确性和效率。由于不同种类毒素的化学多样性，这阻碍了LC/MS等技术的选择性和多分析物能力，因此检测多种真菌毒素仍然是一个巨大的挑战。
技术实现思路
[0003]适配子是单链DNA或RNA寡核苷酸，在生物学领域是一种可靠且有前途的靶向剂。核酸适配子因其对靶标的特殊结合亲和力和特异性而被视为化学或核酸抗体。此外，适配子与蛋白质抗体相比还显示出一些优势，包括高稳定性、易于化学合成、低成本、适应性修饰、低免疫原性和大的组织渗透性。因此，适配子被认为是重金属、小分子、肽和蛋白质生物传感的一个有希望的候选物。为了提高基于适配子的策略的灵敏度，杂交链式反应因其独特的优点，如无酶和等温条件而备受关注。它还与各种信号传导机制耦合：比色法、荧光、电化学和电化学发光。DNA镊子是一种镊子形状的纳米器件，由DNA序列通过Watson
‑
Crick碱基配对编程和构建。它可以执行纳米级的运动，以控制响应调节器的“开”和“关”。DNA镊子也可以通过一起构建多个DNA镊子来用于多个分析物筛选。
[0004]荧光检测策略因其良好的水溶性而引起了极大的研究兴趣，并在许多应用中具有巨大的潜力，信号转换效率高，生物相容性好，实时检测。它还可以通过与适配子结合来检测各种真菌毒素。
[0005]为解决现有技术的问题，本专利技术提供一种靶控选择杂交链式反应，用于多种真菌毒素荧光检测。在金纳米颗粒上修饰了两种真菌毒素适配子。在相应的靶点存在下，适配子可以与其靶点结合并释放一个短DNA触发序列。短DNA触发序列可以与其他发夹杂交并诱导杂交链式反应。通过选择杂交可以形成一个长的双链，使两个发夹的尾部靠近，从而产生一个完整的侧链DNA。侧链DNA的序列取决于杂交链式反应的不同反应路线，而杂交链式反应受特定靶点控制。此外，侧链DNA与DNA镊子的锁定序列互补。因此，它可以打开DNA镊子，使荧光信号显著恢复。赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1的浓度可以通过相应的荧光强度进行定
量测定。此外，它可以提供高灵敏度和高选择性的同时检测双真菌毒素的真实食品样品。
[0006]具体来讲，本专利技术是一种基于靶控选择杂交链式反应的同时检测赭曲霉毒素A(OTA)和黄曲霉毒素B1(AFB1)的方法，包括如下步骤：
[0007]1)合成金纳米颗粒；
[0008]2)在10mM的pH 7.5的PBS溶液中，将巯基修饰的赭曲霉毒素A适配子、巯基修饰的黄曲霉毒素B1适配子、赭曲霉毒素A短触发DNA序列和黄曲霉毒素B1短触发DNA序列杂交；
[0009]其中，巯基修饰的赭曲霉毒素A适配子序列为GATC GGGT GTGG GTGG CGTA AAGG GAGC ATCG GACA AAGT GG
‑
HS；黄曲霉毒素B1适配子序列为GTTG GGCA CGTG TTGT CTCT CTGT GTCT CGTG CCCT TCGC TAGG CCCA CTTT GTA
‑
HS；赭曲霉毒素A短触发DNA序列为AGGC CCAC TTTG TCCG AT，黄曲霉毒素B1短触发DNA序列GTCG TACA AAGT GGGC CT；
[0010]3)将步骤1)所得的金纳米颗粒与步骤2)所得的杂交适配子一起孵育；
[0011]4)DNA镊子的形成：将用于形成DNA镊子的序列1
‑
6混合孵育，以形成DNA镊子，其中用于形成DNA镊子的序列1
‑
6依次分别为：带有Cy5荧光基团的Cy5
‑
GG
‑
TTTA TA
‑
T
‑
C
‑
ACCG TA
‑
TA
‑
BHQ3(BHQ3是荧光基团Cy5的荧光淬灭剂)；带有FAM荧光基团的FAM
‑
AA
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TGGC CT
‑
A
‑
C
‑
AA TATT
‑
CG
‑
DABCYL(DABCYL是荧光基团FAM的荧光淬灭剂)；AATATT
‑
TAGG ACTC AGAT GTTT
‑
CCCC
‑
GGTA GTAT CTAT CCTG
‑
TATAAA；TACGGT
‑
GATT ACAG CGAG GTTG
‑
CCCC
‑
GGAT CACT ACAC AGTA
‑
AGGCCA；CAGG ATAG ATAC TACC
‑
AA
‑
CAAC CTCG CTGT AATC；TACT GTGT AGTG ATCC
‑
AT
‑
AAAC ATCT GAGT CCTA；
[0012]5)将待检测液与步骤3)所得产物混合孵育；
[0013]6)将步骤5)所得产物与选择发卡、发卡1和发卡2混合孵育，其中选择发卡序列ATCGGA
‑
CAAAGT GGGCCT
‑
CAAAGT
‑
AGGCCC ACTTTG
‑
TACGAC，发卡1序列为TATACGGTG
‑
AGGCCC ACTTTG
‑
TCCGAT
‑
CAAAGTGGGCCT
‑
ACTTTG
‑
ATATAAACC，发卡2序列为CGAATATTG
‑
ACTTTG
‑
AGGCCC ACTTTG
‑
GTCGTA
‑
CAAAGT GGGCCT
‑
TAGGCCATT；
[0014]7)将步骤6)所得产物与步骤4)所得DNA镊子混合孵育；
[0015]8)检测步骤7)所得产物的荧光信号，用标准曲线法对赭曲霉毒素A和黄曲霉毒本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于靶控选择杂交链式反应的同时检测赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1的方法，包括如下步骤：1)合成金纳米颗粒；2)在10mM的pH 7.5的PBS溶液中，将巯基修饰的赭曲霉毒素A适配子、巯基修饰的黄曲霉毒素B1适配子、赭曲霉毒素A短触发DNA序列和黄曲霉毒素B1短触发DNA序列杂交；其中，巯基修饰的赭曲霉毒素A适配子序列为GATC GGGT GTGG GTGG CGTA AAGG GAGC ATCG GACA AAGT GG
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HS；黄曲霉毒素B1适配子序列为GTTG GGCA CGTG TTGT CTCT CTGT GTCT CGTG CCCT TCGC TAGG CCCA CTTT GTA
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HS；赭曲霉毒素A短触发DNA序列为AGGC CCAC TTTG TCCG AT，黄曲霉毒素B1短触发DNA序列GTCG TACA AAGT GGGC CT；3)将步骤1)所得的金纳米颗粒与步骤2)所得的杂交适配子一起孵育；4)DNA镊子的形成：将用于形成DNA镊子的序列1
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6混合孵育，以形成DNA镊子，其中用于形成DNA镊子的序列1
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6依次分别为：带有Cy5荧光基团的Cy5
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GG
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TTTA TA
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T
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C
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ACCG TA
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TA
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BQH3,其中，BHQ3是荧光基团Cy5的荧光淬灭剂；带有FAM荧光基团的FAM
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AA
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TGGC CT
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A
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C
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AA TATT
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CG
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DABCYL，其中DABCYL是荧光基团FAM的荧光淬灭剂；AATATT
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TAGG ACTC AGAT GTTT
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CCCC
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GGTA GTAT CTAT CCTG
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TATAAA；TACGGT
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GATT ACAG CGAG GTTG
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CCCC
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GGAT CACT ACAC AGTA
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AGGCCA；CAGG ATAG ATAC TACC
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AA
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CAAC CTCG CTGT AATC；TACT GTGT AGTG ATCC
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AT<...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨黎，
申请(专利权)人：绵阳市第三人民医院，
类型：发明
国别省市：
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