平行核酸分析方法技术

本发明专利技术提供了一种检测多个样本中目标核酸的方法，该方法包括以下步骤：a)在用于每个样本的单独容器中提供来自多个样本的分析物核酸，其中所述容器布置成子集阵列，其中所述阵列包括两个或更多个子集；b)使用与所述分析物核酸杂交的至少一对引物对通过引物延伸反应扩增核酸，其中引物对包含正向引物和反向引物，其中所述正向引物和反向引物均分别包含接头序列、样本标识符序列和用于与所述分析物核酸杂交的结合序列；c)将两个或更多个子集的容器的步骤b)的扩增的核酸组合成组合容器的阵列，其中一个子集而非另一子集的容器组合成组合容器；d)使用与步骤c)的组合容器的所述扩增的核酸杂交的至少一对另外的引物对通过引物延伸反应扩增核酸，其中另外的引物对包含另外的正向引物和另外的反向引物，其中所述另外的正向引物和另外的反向引物均包含子集标识符序列和用于与所述接头序列杂交的序列；e)确定步骤d)扩增的核酸的序列；f)通过与具有所述子集标识符序列和所述样本标识符序列的子集和容器相关联，将步骤e)的确定的目标核酸序列分配给样本。还提供了用于这种方法的引物组。配给样本。还提供了用于这种方法的引物组。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】平行核酸分析方法
[0001]本专利技术涉及平行核酸分析领域。

技术介绍

[0002]在短短几个月内，新出现的冠状病毒Sars
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CoV2导致了Covid
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19全球大流行病。世界在等待有效且可规模化的疫苗接种和抗病毒疗法，同时，必须尽可能好地控制Covid
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19。为此，有两种措施可用，即保持社交距离(例如通过封锁措施)和用于接触者追踪和随机监视的分子测试。然而，检测活动性疾病(即从拭子、漱口液、痰液或唾液中检测病毒RNA的存在)的分子方法目前成本高昂，并且受到设备和试剂供应短缺的阻碍。可以通过在混并的(pooled)RNA提取物中进行PCR检测来实施大规模测试(Ben
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Ami et al.,Clinical Microbiology and Infection 2020,26:1248
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1253)。但是，这种混并方法可能需要重新测试以识别阳性测试池中的单个阳性样本。为了在多重(multiplex)方法中识别单个样本，将样本来源的DNA通过特定的核苷酸序列进行条码化(Dao Thi et al.,Sci.Transl.Med.2020；12:eabc7075)。病毒序列伴随条码序列一起被确定，从而建立各个样本中病毒存在的联系。然而，一般而言，多路技术会降低测定的灵敏度和/或提高病毒遗传物质的检测限(Visseaux et al.,J Clin Micr 2020,58(8):e00630
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20)。
[0003]仍然需要进一步增加测试能力，同时降低测试成本，并且优选还保持或提高测试灵敏度。本专利技术的目标是提高大规模测试能力以满足这些需求。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种检测多个样本中目标核酸的方法，该方法包括以下步骤：a)在用于每个样本的单独容器中提供来自多个样本的分析物核酸，其中所述容器布置成子集阵列，其中所述阵列包括两个或更多个子集；b)使用与所述分析物核酸杂交的至少一对引物对通过引物延伸反应扩增核酸，其中引物对包含正向引物和反向引物，其中所述正向引物和反向引物均分别包含接头序列、样本标识符序列和用于与所述分析物核酸杂交的结合序列；c)将两个或更多个子集的容器的步骤b)的扩增的核酸组合成组合容器的阵列，其中一个子集而非另一子集的容器组合成组合容器；d)使用与步骤c)的组合容器的所述扩增的核酸杂交的至少一对另外的引物对通过引物延伸反应扩增核酸，其中另外的引物对包含另外的正向引物和另外的反向引物，其中所述另外的正向引物和另外的反向引物均包含子集标识符序列和用于与所述接头序列杂交的序列；e)确定步骤d)扩增的核酸的序列；f)通过与具有所述子集标识符序列和所述样本标识符序列的子集和容器相关联，将步骤e)的确定的目标核酸序列分配给样本。
[0005]本专利技术进一步提供了适用于本专利技术方法的引物组。这种组可以包括：至少10个不同的引物A，该至少10个不同的引物A从5
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到3
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包含序列：接头A序列、长度至少为4nt的标识符序列、和靶结合序列，其中在所述至少10个不同的引物A中所述标识符序列是不同的，可选地具有至少为1的汉明距离(Hamming distance)或至少为1的编辑距离(Levenshtein distance)的序列距离；至少10个不同的引物B，该至少10个不同的引物B从5'到3'包含序
列：接头B序列、长度至少为4nt的标识符序列、和靶结合序列，其中在所述至少10个不同的引物B中所述标识符序列是不同的，可选地具有至少为1的汉明距离或至少为1的编辑距离的序列距离；至少10个不同的引物C，该至少10个不同的引物C从5'到3'包含序列：接头C序列、长度至少为4nt的标识符序列、和与所述接头A序列结合的结合序列，其中在所述至少10个不同的引物C中所述标识符序列是不同的，可选地具有至少为1的汉明距离或至少为1的编辑距离的序列距离；以及至少10个不同的引物D，该至少10个不同的引物D从5'到3'包含序列：接头D序列、长度至少为4nt的标识符序列、和与所述接头B序列结合的结合序列，其中在所述至少10个不同的引物D中所述标识符序列是不同的，可选地具有至少为1的汉明距离或至少为1的编辑距离的序列距离。
[0006]在优选的实施方式中，目标核酸是RNA，例如来自RNA病毒。该方法包括在步骤a)中将RNA转化为cDNA。因此，本专利技术的方法也可以写成检测多个样本中包括核糖核酸(RNA)的目标核酸的方法，该方法包括以下步骤：a)在用于每个样本的单独容器中提供来自多个样本的分析物核酸，其中所述容器布置成子集阵列，其中所述阵列包括两个或更多个子集；包括逆转录RNA，从而产生RNA的互补DNA作为分析物核酸；b)使用与所述分析物核酸杂交的至少一对引物对通过引物延伸反应扩增核酸，特别是DNA，其中引物对包含正向引物和反向引物，其中所述正向引物和反向引物均分别包含接头序列、样本标识符序列和用于与所述分析物核酸杂交的结合序列；其中所述扩增优选地是DNA特异性的和/或使用DNA聚合酶的；c)将两个或更多个子集的容器的步骤b)的扩增的核酸组合成组合容器的阵列，其中一个子集而非另一子集的容器组合成组合容器；d)使用与步骤c)的组合容器的所述扩增的核酸杂交的至少一对另外的引物对通过引物延伸反应扩增核酸，其中另外的引物对包含另外的正向引物和另外的反向引物，其中所述另外的正向引物和另外的反向引物均包含子集标识符序列和用于与所述接头序列杂交的序列；e)确定步骤d)扩增的核酸的序列；f)通过与具有所述子集标识符序列和所述样本标识符序列的子集和容器相关联，将步骤e)的确定的目标核酸序列分配给样本。
[0007]本专利技术的公开内容同样涉及本专利技术的所有方面，例如，方法的描述也涉及作为该组的适用性或该组的用途；同样，该组的描述也涉及其可在该方法中使用的组件。特别地，引物A和B可以用作正向引物和反向引物；引物C和D可以用作另外的正向引物和另外的反向引物。
具体实施方式
[0008]本专利技术提供了一种检测多个样本中目标核酸的方法。这种目标核酸可以例如来自病原体，例如病毒、细菌或真菌，因此用于通过其核酸检测所述病原体。这允许将该方法用于诊断与病原体存在相关的疾病。
[0009]通常，目标核酸是预先选择的，即通过使用与目标核酸结合的引物预先选择。因此，本专利技术的方法可用于检测特定目标病原体的存在。
[0010]本专利技术的方法通常在体外进行，即根据本专利技术离体分析样本和/或在先前已从中获得样本的对象体外分析样本。
[0011]从中获得样本的对象可以是例如人或非人动物，例如哺乳动物、鸟类或爬行动物。优选地，对象是哺乳动物，特别是人。
[0012]样本可以来自或包含生物样本，例如体液，例如痰液、唾液、鼻粘液、支气管肺泡灌洗液、尿液、血清或血液样本。这种含有痰液、唾液或鼻粘液的样本可以从鼻咽拭子、口咽拭子、鼻拭子、漱口液获得或将痰液提供到容器中获得。更通常，样本可以是固体样本、液体样本或气态呼本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种检测多个样本中目标核酸的方法，包括以下步骤：a)在用于每个样本的单独容器中提供来自多个样本的分析物核酸，其中所述容器布置成子集阵列，其中所述阵列包括两个或更多个子集；b)使用与所述分析物核酸杂交的至少一对引物对通过引物延伸反应扩增核酸，其中引物对包含正向引物和反向引物，其中所述正向引物和反向引物均分别包含接头序列、样本标识符序列和用于与所述分析物核酸杂交的结合序列；c)将两个或更多个子集的容器的步骤b)的扩增的核酸组合成组合容器的阵列，其中一个子集而非另一子集的容器组合成组合容器；d)使用与步骤c)的组合容器的所述扩增的核酸杂交的至少一对另外的引物对通过引物延伸反应扩增核酸，其中另外的引物对包含另外的正向引物和另外的反向引物，其中所述另外的正向引物和另外的反向引物均包含子集标识符序列和用于与所述接头序列杂交的序列；e)确定步骤d)扩增的核酸的序列；f)通过与具有所述子集标识符序列和所述样本标识符序列的子集和容器相关联，将步骤e)的确定的目标核酸序列分配给样本。2.根据权利要求1所述的方法，其中，i)在步骤b)中，对于给定的用于与所述分析物核酸杂交的结合序列，所述正向引物的每个样本标识符序列与其他正向引物的样本标识符序列不同；和/或ii)在步骤b)中，对于给定的用于与所述分析物核酸杂交的结合序列，所述反向引物的每个样本标识符序列与其他反向引物的样本标识符序列不同；和/或iii)在步骤d)中，所述另外的正向引物的每个子集标识符序列与其他另外的正向引物的子集标识符序列不同；和/或iv)在步骤d)中，所述另外的反向引物的每个子集标识符序列与其他另外的反向引物的子集标识符序列；优选i)、ii)、iii)和iv)的组合。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤d)的所述另外的引物包含测序接头序列。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，步骤a)包括提供来自样本的RNA并通过逆转录产生所述RNA的cDNA，其中在步骤b)中扩增的核酸包含所述cDNA。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，步骤b)的所述正向引物和反向引物中的至少一个在步骤b)期间和/或之后但在步骤c)之前被耗尽；优选其中所述耗尽在步骤b)期间并且包括用所述正向引物和/或反向引物扩增加标核酸；和/或优选其中所述正向引物和反向引物的所述耗尽包括用单链特异性核酸酶处理。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，步骤d)中的扩增核酸限于最多35个扩增循环，优选最多20个扩增循环。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述多个样本包括4000个或更多个样本和/或所述两个或更多个子集是40个或更多个子集和/或其中子集包括40个或更多个
容器。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述目标核酸是病原体核酸，优选病毒核酸。9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述目标核酸选自冠状病毒核酸，优选SARS
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CoV
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2核酸、流感病毒核酸、副流感病毒核酸、鼻病毒核酸或其组合。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，选择两种或更多种目标核酸，优选其中所述两种或更多种目标核酸来自病毒，所述病毒对于两种或更多种目标核酸是相同的...

【专利技术属性】
技术研发人员：U，
申请(专利权)人：IMBA莫利库尔生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：