本发明专利技术公开了一种促进丹参酮积累的基因SmCYP82U4，该基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所述。本发明专利技术还同时公开了基因SmCYP82U4促进丹参酮积累的应用，通过基因表达分析发现过表达SmCYP82U4极显著提高了迷迭香酸、丹参酮I和丹参酮IIA的含量。丹参酮IIA的含量。
【技术实现步骤摘要】
高效促进丹参酮积累的基因SmCYP82U4及其用途
[0001]本专利技术属于生物领域，特别涉及一种正向调控丹参酮合成的SmCYP82U4 基因及其功能研究。
技术介绍
[0002]CYPs是植物进化过程中很好的报告者，特别是进化和植物代谢在发育和适应中的作用，CYPs构成了迄今为止植物代谢中最大的酶家族。SmCYP82U4的过表达显著提高了SmDXS和SmCPS基因表达和丹参酮积累。但是促进效果仍然有待改善。
技术实现思路
[0003]本专利技术要解决的技术问题是提供一种可以大幅促进丹参酮积累的 SmCYP82U4基因及其用途。
[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种促进丹参酮积累的SmCYP82U4 基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。
[0005]本专利技术还同时提供了上述SmCYP82U4的用途，促进丹参酮积累。
[0006]作为本专利技术的SmCYP82U4的用途的改进：促进迷迭香酸、丹参酮I和丹参酮IIA的积累。
[0007]本专利技术通过转录组发现，绒毛鼠尾草和丹参中共有7个CYP基因表达差异显著，其中SmCYP82U4在转录组水平上表达量高达丹参的16倍，进一步的 RT
‑
PCR验证结果表明，CYP82U4在绒毛鼠尾草中表达量是丹参的两千倍，为此，本专利技术采用基因过表达的方法研究了SmCYP82U4对丹参酮积累的调控作用，结果发现SmCYP82U4可以将丹参酮I的含量提高18.91倍，丹参酮IIA的含量提高42.35倍。
[0008]本专利技术具有如下优势：
[0009]1、SmCYP82U4促进迷迭香酸积累，提高到5.69倍；
[0010]2、SmCYP82U4促进丹参酮I积累，提高18.91倍；
[0011]3、SmCYP82U4促进丹参酮II积累，提高42.35倍。
[0012]综上所述，本专利技术利用基因过表达的方法发现了一个可以更加显著促进丹参酮I、丹参酮IIA和迷迭香酸积累的SmCYP82U4。
附图说明
[0013]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。
[0014]图1为SmCYP82U4基因的cDNA扩增电泳图；
[0015]图2为SmCYP82U4的生物信息分析图(ASmCYP82U4蛋白序列；B、C、D为 SmCYP82U4氨基酸组成成分分析；E为SmCYP82U4三级结构预测；F为 SmCYP82U4亚细胞定位)；
[0016]图3为SmCYP82U4过表达丹参毛状根株系图；
[0017]图4为SmCYP82U4过表达毛状根鉴定电泳图；
[0018]图5为转基因毛状根和野生丹参毛状根的次生代谢物含量图。
具体实施方式
[0019]下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此。
[0020]实验材料
[0021]1.1植物材料
[0022]以MS液体培养基中继代培养的丹参和绒毛鼠尾草毛状根为材料，精确称取 0.2g毛状根接种到含有50mL MS液体培养基中，25℃、110rpm/min培养24 天后待用。
[0023]1.2菌株、载体及引物
[0024]菌株：大肠杆菌DH5α和发根农杆菌15834
[0025]载体：pMD19
‑
T；中间载体pDONR207；过表达载体pK7WG2R。
[0026]引物：
[0027][0028][0029]实施例1基因的克隆及分析
[0030]1、RNA的提取及cDNA的获得
[0031]RNA的提取参照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441)说明书进行，在Microtube中配置反应液，获得cDNA。
[0032]2、基因的克隆
[0033](1)序列获得
[0034]以丹参毛状根cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系为PCR buffer 5μl， dNTPs 4μl，PrimerF 1μl，PrimerR 1μl，cDNA 2μl，Taq酶0.3μl，H2O 36.7μl； PCR反应条件为98℃10s，60℃5s，68℃1min，共33个循环。
[0035](2)连接转化
[0036]①
PCR产物电泳后，用手术刀对扩增获得的条带进行切割，利用Takara割胶回收试剂盒(6013)，按照说明书进行胶回收；
[0037]②
加入感受态细胞ATCC15834发根农杆菌30μl，冰中放置30min；
[0038]③
42℃加热45s后冰上放置2min；
[0039]④
加适量LB培养基，37℃振荡培养4min；
[0040]⑤
离心取上清，留200μl涂板。
[0041](3)阳性克隆鉴定
[0042]菌斑清晰可见后进行挑斑，用无菌枪头挑取培养皿上单个菌斑，接种在LB培养基中，37℃，220rmp震荡摇菌240分钟，测序后确认attB
‑
PCR产物。
[0043]SmCYP82U4基因的克隆及生物信息分析结论：
[0044]以cDNA为模板扩增SmCYP82U4的ORF区，扩增结果如图1所示。目的条带进行胶回收及连接pMD19
‑
T载体，挑选单克隆摇菌，选取阳性克隆进行测序。测序后发现SmCYP82U4全长为1569bp。预测编码蛋白质的分子量是58.80KD，等电点为7.825。它的二级结构和三级结构如图所示。SmCYP82U4基因共编码522 个氨基酸(图2A)，其中L(亮氨酸)、G(甘氨酸)和S(丝氨酸)数量校多，亚细胞定位于内质网。
[0045]实施例2过表达载体的构建
[0046]1、BP反应
[0047]①
BP反应体系如下所示：
[0048]BP反应体系
[0049]②
25℃过夜连接；
[0050]③
加入Proteinase K终止反应；
[0051]④
加大肠杆菌DH5α转化后涂板，抗性为庆大霉素(100μg/ml)；
[0052]⑤
菌液PCR鉴定提质粒，得pDONR207
‑
目的基因载体。
[0053]2、LR反应
[0054]①
LR反应体系如下所示：
[0055]LR反应体系
[0056][0057]②
25℃过夜连接；
[0058]③
加入1μl Proteinase K，37℃10min；
[0059]④
加大肠杆菌DH5α转化后涂板，抗性为壮观霉素(100μg/ml)；
[0060]⑤
菌液PCR鉴定后提质粒。
[0061]3、目的基因过表达载体的转化
[0062]①
将丹参无菌苗叶片切成0.5cm2左右的小块，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.促进丹参酮积累的基因SmCYP82U4，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。2.如权利要求1所述的基因SmC...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨东风，杜旭红，陈依雯，王艳婷，梁宗锁，
申请(专利权)人：浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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