VSIG4基因人源化非人动物的构建方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种人源化VSIG4蛋白、一种人源化VSIG4基因、一种VSIG4基因的靶向载体、一种VSIG4基因人源化改造非人动物的构建方法、一种人源化的非人动物和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人VSIG4蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化VSIG4蛋白，可以作为人VSIG4信号机理研究、肿瘤及免疫性疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。重要的应用价值。重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
VSIG4基因人源化非人动物的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种VSIG4基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

技术介绍

[0002]VSIG4蛋白全称为V
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set and immunoglobulin domain containing 4，又名补体受体免疫球蛋白(Complement Receptor Immunoglobulin，CRIg)，是免疫球蛋白超家族成员之一，为单次跨膜蛋白，人体中有两种存在形式，包括C2结构域和V结构域的长蛋白和只包括V结构域的短蛋白，小鼠中只有一种含有V结构域的VSIG4蛋白。虽然VSIG4的mRNA在不同组织例如肝脏、肺、胎盘、滑膜、中心神经系统等组织器官中表达，但其蛋白在正常组织中仅集中在肝脏巨噬细胞，滑膜等组织中有微量表达，具有高度巨噬细胞表达特异性。VSIG4可以介导细菌和病毒的清除，可与补体系统中的C3b和C3c结合，参与C3b介导的调理作用，并抑制补体激活通路的活化。虽然VSIG4在调理细菌的吞噬作用中起主要受体作用，越来越多的证据显示其在免疫抑制、抗炎症反应、感染中也发挥着重要功能。体外实验中，VSIG4可溶性重组蛋白能够抑制CD4+、CD8+T细胞和NKT细胞的增殖与活性，抑制细胞因子IL2的表达，促进Foxp3+调节性T细胞(Treg)的分化，在肿瘤的生成和发展中起着重要的调节作用。
[0003]实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。
[0004]鉴于VSIG4在感染、自身免疫性疾病及肿瘤等治疗领域的巨大应用潜力，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发VSIG4基因改造非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本专利技术在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一方面，提供了一种人源化VSIG4蛋白，所述的人源化VSIG4蛋白包含人VSIG4蛋白的全部或部分。
[0006]优选的，所述的人源化VSIG4蛋白包含人VSIG4蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化VSIG4蛋白包含人VSIG4蛋白的胞外区的全部或部分。
[0007]优选的，所述的人源化VSIG4蛋白包含人VSIG4蛋白的胞外区的全部或部分，所述的人源化VSIG4蛋白包含至少50个连续氨基酸的人VSIG4蛋白胞外区，例如至少包含50、70、100、110、120、150、170、200、210、230、250、260、261、262、263、264个连续氨基酸的人VSIG4蛋白胞外区，进一步优选的，包含262或264个连续氨基酸的人VSIG4蛋白胞外区；更优选的，包含与SEQ ID NO:2的第20
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281或20
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283位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第20
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281或20
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283位所示氨基酸序列；所述的人源化VSIG4蛋白还包含人VSIG4蛋白信号肽的全部或部分，优选的，包含与SEQ ID NO:2的第1
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19位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第1
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19位所示氨基酸序列；所述的人源化VSIG4蛋白还包含人VSIG4蛋白跨膜区的全部或部分，优选的，包含与SEQ ID NO:2的第284
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304位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第284
‑
304位所示氨基酸序列；所述的人源化VSIG4蛋白还包含人VSIG4蛋白胞质区的全部或部分，优选的，包含与SEQ ID NO:2的第305
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399位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第305
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399位所示氨基酸序列。
[0008]优选的，所述的人源化VSIG4蛋白包含SEQ ID NO：2第20
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281或1
‑
399位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第20
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281或1
‑
399位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第20
‑
281或1
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399位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第20
‑
281或1
‑
399位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
[0009]优选的，所述的人源化VSIG4蛋白还包含非人动物VSIG4蛋白的全部或部分，进一步优选的，包含SEQ ID NO：1第1
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19位或186
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210位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1第1
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19位或186
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210位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：1第1
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19位或186
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210位所示氨基酸序列差异不超本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人源化VSIG4蛋白，其特征在于，所述的人源化VSIG4蛋白包含人VSIG4蛋白的全部或部分。2.根据权利要求1所述的人源化VSIG4蛋白，其特征在于，所述的人源化VSIG4蛋白包含人VSIG4蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区，优选的，所述的人源化VSIG4蛋白包含人VSIG4蛋白的胞外区的全部或部分，进一步优选的，包含人VSIG4蛋白胞外区至少50个连续氨基酸，优选包含SEQ ID NO：2第20
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281或20
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283位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第20
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281或20
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283位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第20
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281或20
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283位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第20
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281或20
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283位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的人源化VSIG4蛋白，其特征在于，所述的人源化VSIG4蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：A)SEQ ID NO：11或2所示氨基酸序列；B)与SEQ ID NO：11或2所示氨基酸序列同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；C)与SEQ ID NO：11或2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或D)与SEQ ID NO：11或2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。4.一种编码权利要求1
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3任一项所述人源化VSIG4蛋白的核酸。5.一种人源化VSIG4基因，其特征在于，所述的人源化VSIG4基因包含人VSIG4基因的部分。6.根据权利要求5所述的人源化VSIG4基因，其特征在于，所述的人源化VSIG4基因包含人VSIG4基因的1号至8号外显子的全部或部分，或者，包含2号至6号外显子的全部或部分；优选的，包含1号外显子的部分、2号外显子至7号外显子的全部和8号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，8号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，或者，包含2号外显子的部分、3号外显子至5号外显子的全部和6号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，6号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列。7.根据权利要求5或6所述的人源化VSIG4基因，其特征在于，所述的人源化VSIG4基因包含SEQ ID NO：5或30所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5或30所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5或30所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5或30所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。8.根据权利要求5
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7任一所述的人源化VSIG4基因，其特征在于，所述的人源化VSIG4基因还包含非人动物VSIG4基因的1号外显子和/或6
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7号外显子的全部或部分，更进一步优选还包含2号外显子的部分和/或5号外显子的部分核苷酸序列。
9.根据权利要求5
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8任一所述的人源化VSIG4基因，其特征在于，所述的人源化VSIG4基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：A)转录的mRNA为SEQ ID NO：10或33所示核苷酸序列；B)转录的mRNA与SEQ ID NO：10或33所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；C)转录的mRNA与SEQ ID NO：10或33所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：10或33所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，E)包含SEQ ID NO：6、7和/或58所示的核苷酸序列。10.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：A)编码人或人源化VSIG4蛋白的核苷酸序列；B)编码人VSIG4蛋白的胞外区、跨膜区、胞质区和/或信号肽的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人VSIG4蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列，优选编码人VSIG4蛋白的胞外区至少50个连续氨基酸的核苷酸序列；C)人或人源化VSIG4基因的核苷酸序列；或，D)人VSIG4基因的1号至8号外显子的全部或部分，或者，人VSIG4基因的2号至6号外显子的全部或部分；优选的，人VSIG4基因的1号外显子的部分、2号外显子至7号外显子的全部和8号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，8号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，或者，人VSIG4基因的2号外显子的部分、3号外显子至5号外显子的全部和6号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，6号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，进一步优选包含SEQ ID NO：5、30或31所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5、30或31所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5、30或31所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5、30或31所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。11.根据权利要求10所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5
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臂和/或3
’
臂，优选的，所述的5
’...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕锐利，尚诚彰，聂琰晖，
申请(专利权)人：百奥赛图北京医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：