本发明专利技术提供了一种重组人促红细胞生成素的检测方法,包括如下步骤:获取重组人促红细胞生成素的对照品;将含重组人促红细胞生成素的细胞培养上清进行层析,制备待测样品;分别将所述对照品与所述待测样品进行阴离子高效液相色谱检测;其中,阴离子高效液相色谱检测的条件包括:流动相A为20mmol/L~40mmol/L的甲酸铵溶液,流动相B为20mmol/L~40mmol/L的甲酸溶液,流动相C为三羟甲基氨基甲烷与氯化钠的混合溶液,流动相C中,三羟甲基氨基甲烷的浓度为5mmol/L~15mmol/L,氯化钠的浓度为0.8mol/L~1.2mol/L;采用梯度洗脱。采用梯度洗脱。采用梯度洗脱。
【技术实现步骤摘要】
重组人促红细胞生成素的检测方法
[0001]本专利技术涉及生物
,特别是涉及一种重组人促红细胞生成素的检测方法。
技术介绍
[0002]人体中的促红细胞生成素是由肾皮质肾小管周围间质细胞和肝脏分泌的一种激素样物质,能够促进红细胞生成。内源性促红细胞生成素是由165个氨基酸组成的多肽,同时含有3个N
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糖基化位点和1个O
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糖基化位点,分子量约30kDa,糖链约占总分子量的40%,糖链对其体内的生物活性有较大影响。促红细胞生成素糖基化的一个重要影响因素是唾液酸的含量,未发生唾液酸修饰的糖链末端裸露的半乳糖会被肝脏半乳糖受体识别,从而快速被清除。进一步研究表明,唾液酸如果发生了O
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乙酰化修饰,其保护作用也会增强。更具体地说,大量的唾液酸与EPO体内生物活性和半衰期的增加有关。商品化的促红细胞生成素都是重组人促红细胞生成素(rhEPO),重组人促红细胞生成素与内源性促红细胞生成素的氨基酸序列完全相同,仅糖基部分有微小差别。重组人促红细胞生成素比内源性促红细胞生成素含有更多的三天线和四天线低聚糖,并且二者在唾液酸化程度上有较大差别。唾液酸化程度的不同会导致重组人促红细胞生成素存在电荷异质性,形成不同的电荷异构体。
[0003]传统的检测电荷异构体方法有等电聚焦电泳(IEF)、毛细管等电聚焦电泳(cIEF)、离子交换色谱(CEX)等。中国药典2020版三部中描述的标准方法依赖于通过等电聚焦电泳法分离重组人促红细胞生成素的电荷异构体。图1所示为重组人促红细胞生成素标准品的等电聚焦电泳图,该标准品主要有重组人促红细胞生成素电荷异构体4
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7,共4个条带,异构体3条带相对不明显。等电聚焦电泳可快速检测蛋白的等电点,普及性较广,但在IEF图谱上是弥散条带,无法精确分析每个电荷异构体,因此等电聚焦电泳法主要用于定性分析,而无法进行重组人促红细胞生成素电荷异构体的准确定量。
[0004]相较于等电聚焦电泳法,毛细管等电聚焦可更精确地分离每个重组人促红细胞生成素的电荷异构体,与等电聚焦电泳的原理一样,是根据蛋白表面电荷分布差异分离多种变体,但毛细管等电聚焦电泳操作耗时,不易标准化,并且还需要配备专门的电泳设备,成本较高。
技术实现思路
[0005]基于此,本专利技术提供了一种重组人促红细胞生成素的检测方法,其能快速完成重组人促红细胞生成素酸性异构体含量的检测,准确性较高,且对样品纯度要求较低。
[0006]本专利技术通过如下技术方案实现。
[0007]一种重组人促红细胞生成素的检测方法,包括如下步骤:
[0008]获取重组人促红细胞生成素的对照品;
[0009]将含重组人促红细胞生成素的细胞培养上清进行层析,制备待测样品;
[0010]分别将所述对照品与所述待测样品进行阴离子高效液相色谱检测;
[0011]其中,阴离子高效液相色谱检测的条件包括:流动相A为20mmol/L~40mmol/L的甲
酸铵溶液,流动相B为20mmol/L~40mmol/L的甲酸溶液,流动相C为三羟甲基氨基甲烷与氯化钠的混合溶液,流动相C中,三羟甲基氨基甲烷的浓度为5mmol/L~15mmol/L,氯化钠的浓度为0.8mol/L~1.2mol/L;采用梯度洗脱;梯度洗脱的程序包括:0min~10min,流动相A的体积百分数为100%;10min~60min,流动相A的体积百分数从100%变化至0%,流动相B的体积百分数从0变化至100%;60min~70min,流动相B的体积百分数保持为100%;70min~71min,流动相B的体积百分数从100%变化至0%,流动相C的体积百分数从0%变化至100%;71min~85min,流动相C的体积百分数保持为100%;85min~86min,流动相A的体积百分数从0%变化至100%,流动相C的体积百分数从100%变化至0%;86min~100min,流动相A的体积百分数保持为100%。
[0012]在其中一个实施例中,阴离子高效液相色谱检测的条件还包括:流速为1mL/min
±
0.1mL/min。
[0013]在其中一个实施例中,阴离子高效液相色谱检测的条件还包括:检测波长为280nm
±
5nm。
[0014]在其中一个实施例中,阴离子高效液相色谱检测的条件还包括:柱温为30℃
±
2℃。
[0015]在其中一个实施例中,阴离子高效液相色谱检测的条件还包括:色谱柱为强阴离子交换柱。
[0016]在其中一个实施例中,将含重组人促红细胞生成素的细胞培养上清进行层析包括如下步骤:
[0017]采用第一平衡液对第一色谱柱进行平衡,将所述含重组人促红细胞生成素的细胞培养上清与所述第一平衡液混合后上样,然后用第一洗脱液与所述第一平衡液的混合液洗脱,收集目的蛋白;其中,所述第一色谱柱为阴离子交换色谱柱;所述第一平衡液为5mmol/L~15mmol/L的三羟甲基氨基甲烷;所述第一洗脱液为三羟甲基氨基甲烷与氯化钠的混合溶液,所述第一洗脱液中,三羟甲基氨基甲烷的浓度为5mmol/L~15mmol/L,氯化钠的浓度为450mmol/L~550mmol/L;或
[0018]采用第二平衡液对第二色谱柱进行平衡,将所述含重组人促红细胞生成素的细胞培养上清进行上样,然后用所述第二平衡液洗柱,再用第二洗脱液与所述第二平衡液的混合液洗脱,收集目的蛋白;其中,所述第二色谱柱为反相色谱柱;所述第二平衡液为5mmol/L~15mmol/L的三羟甲基氨基甲烷;所述第二洗脱液为三羟甲基氨基甲烷与乙腈或乙醇的混合溶液,所述第二洗脱液中,三羟甲基氨基甲烷的浓度为5mmol/L~15mmol/L,乙腈或乙醇的体积分数为75%~85%;或
[0019]采用第三平衡液对第三色谱柱进行平衡,将所述含重组人促红细胞生成素的细胞培养上清进行上样,然后用所述第三平衡液洗柱,再用第三洗脱液洗脱,收集目的蛋白;其中,所述第三色谱柱为蓝色琼脂糖凝胶色谱柱;所述第三平衡液为三羟甲基氨基甲烷与氯化钠的混合溶液,所述第三平衡液中,三羟甲基氨基甲烷的浓度为15mmol/L~25mmol/L,氯化钠的浓度为0.13mol/L~0.18mol/L;所述第三洗脱液为三羟甲基氨基甲烷与氯化钠的混合溶液,所述第三洗脱液中,三羟甲基氨基甲烷的浓度为15mmol/L~25mmol/L,氯化钠的浓度为1mol/L~1.4mol/L。
[0020]在其中一个实施例中,层析采用的流速为2mL/min~4mL/min。
[0021]在其中一个实施例中,还包括如下步骤:
[0022]建立所述重组人促红细胞生成素对照品的酸性异构体总峰面积均值与所述重组人促红细胞生成素对照品浓度之间的标准曲线。
[0023]在其中一个实施例中,所述重组人促红细胞生成素对照品的酸性异构体总峰面积均值为y,所述重组人促红细胞生成素对照品的浓度为x,所述标准曲线的函数方程为y=1本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种重组人促红细胞生成素的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:获取重组人促红细胞生成素对照品;将含重组人促红细胞生成素的细胞培养上清进行层析,制备待测样品;分别将所述对照品与所述待测样品进行阴离子高效液相色谱检测;其中,阴离子高效液相色谱检测的条件包括:流动相A为20mmol/L~40mmol/L的甲酸铵溶液,流动相B为20mmol/L~40mmol/L的甲酸溶液,流动相C为三羟甲基氨基甲烷与氯化钠的混合溶液,流动相C中,三羟甲基氨基甲烷的浓度为5mmol/L~15mmol/L,氯化钠的浓度为0.8mol/L~1.2mol/L;采用梯度洗脱,梯度洗脱的程序包括:0min~10min,流动相A的体积百分数为100%;10min~60min,流动相A的体积百分数从100%变化至0%,流动相B的体积百分数从0变化至100%;60min~70min,流动相B的体积百分数保持为100%;70min~71min,流动相B的体积百分数从100%变化至0%,流动相C的体积百分数从0%变化至100%;71min~85min,流动相C的体积百分数保持为100%;85min~86min,流动相A的体积百分数从0%变化至100%,流动相C的体积百分数从100%变化至0%;86min~100min,流动相A的体积百分数保持为100%。2.根据权利要求1所述的重组人促红细胞生成素的检测方法,其特征在于,阴离子高效液相色谱检测的条件还包括:流速为1mL/min
±
0.1mL/min。3.根据权利要求1所述的重组人促红细胞生成素的检测方法,其特征在于,阴离子高效液相色谱检测的条件还包括:检测波长为280nm
±
5nm。4.根据权利要求1所述的重组人促红细胞生成素的检测方法,其特征在于,阴离子高效液相色谱检测的条件还包括:柱温为30℃
±
2℃。5.根据权利要求1所述的重组人促红细胞生成素的检测方法,其特征在于,阴离子高效液相色谱检测的条件还包括:色谱柱为强阴离子交换柱。6.根据权利要求1所述的重组人促红细胞生成素的检测方法,其特征在于,将含重组人促红细胞生成素的细胞培养上清进行层析包括如下步骤:采用第一平衡液对第一色谱柱进行平衡,将所述含重组人促红细胞生成素的细胞培养上清与所述第一平衡液混合后上样,然后用第一洗脱液与所述第一平衡液的混合液洗脱,收集目的蛋白;其中,所述第一色谱柱为阴离子交换色谱柱;所述第一...
【专利技术属性】
技术研发人员:杜保平,张超,陈芬,肖文桥,马鸿杰,崔宁,马玉涛,马动,李思,
申请(专利权)人:深圳科兴药业有限公司,
类型:发明
国别省市:
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