同时检测四种致病菌的多重荧光定量PCR引物探针组、方法及应用技术

本发明专利技术涉及同时检测四种致病菌的多重荧光定量PCR引物探针组、方法及应用，属于分子生物学领域，所述探针引物组包含分别针对金黄色葡萄球菌Nuc基因、沙门氏菌invA基因、单核增生李斯特菌Hly基因和大肠杆菌O157:H7rfbE基因的引物对与探针。本发明专利技术结合实时荧光定量PCR以及多重荧光定量PCR技术，提供的可以同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7四种致病菌的方法，极大地提升检测效率，节约检测成本，满足大规模快速检测的需要。检测的需要。检测的需要。

【技术实现步骤摘要】
同时检测四种致病菌的多重荧光定量PCR引物探针组、方法及应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种同时检测四种致病菌的多重荧光定量 PCR引物探针组、方法及应用。

技术介绍

[0002]金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella)、单核增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes)、大肠杆菌O157：H7(Enterohemorrhagic E.coli O157∶H7)是四种常见的食源性致病菌，也是我国食品安全卫生标准中重点检测的4种致病菌。金黄色葡萄球菌是一种常见的革兰氏阳性菌，广泛分布于自然界中，作为常见的食源性致病菌可产生肠毒素，引起食物中毒、毒素休克综合征、骨髓炎、坏死性肺炎和心内膜炎等严重疾病。沙门氏菌属革兰氏阴性肠道杆菌，其感染症为人畜共患感染性疾病，主要由食用遭受污染的食物导致，蛋、家禽和肉类产品是沙门氏菌病的主要传播媒介，感染主要取决于沙门氏菌的血清型和食用者的身体状况，受威胁最大的是小孩、老年人及免疫缺陷个体。单核增生李斯特菌是一种兼性厌氧革兰氏阳性菌，为李斯特菌症的病原体，主要以食物为传染媒介，该菌在4℃的环境仍可以生长繁殖，是最致命的食源性病原体之一，造成二至三成的感染者死亡。大肠杆菌O157:H7属于肠杆菌科埃希氏菌属革兰氏阴性菌，大肠杆菌O157:H7的感染剂量极低。伏期为3
‑
10天，病程2
‑
9天。通常是突然发生剧烈腹痛和水样腹泻，数天后出现出血性腹泻，可发热或不发热。部分患者可发展为HUS、TTP 等，严重者可导致死亡。
[0003]在食源性致病菌检测中，长久以来都是以传统的分离培养技术作为微生物鉴定和检测的主要方法技术，通常要经过分离培养，染色镜检，生化反应，溶血实验等，确定为某种病原菌后再进一步进行血清分析达到鉴定目的，传统的分离培养鉴定步骤复杂，周期较长，无法满足大规模快速检测的需求。随着分子生物学的发展，实时荧光定量PCR尤其是基于 TaqMan探针的荧光定量PCR技术逐渐应用于食源性致病菌的检测中，与传统的微生物分离培养鉴定相比，荧光定量PCR技术具有灵敏度高、检测周期短、特异性强等优点，由于多对引物和探针组合交叉影响和添加量不同，目前大多使用单重实时荧光定量进行致病菌检测，可同时检测多个目的基因的检测体系较少。无论是在常规食品抽检，还是在应对突发和重大食品安全事故中，都需要进行大规模快速的病原菌检测，因此建立一种同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7的荧光定量PCR体系具有非常重要的实践意义。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术的目的一在于提供一种同时检测四种致病菌的多重荧光定量 PCR引物探针组，目的二在于提供一种检测方法，目的三在于提供所述引物探针组的应用。本专利技术结合实时荧光定量PCR以及多重荧光定量PCR技术，提供的可以同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7四种致病菌的方法，极大地提升
检测效率，节约检测成本，满足大规模快速检测的需要。
[0005]本专利技术采用的具体方案为：同时检测四种致病菌的多重荧光定量PCR引物探针组，包含分别针对金黄色葡萄球菌Nuc 基因、沙门氏菌invA基因、单核增生李斯特菌Hly基因和大肠杆菌O157:H7rfbE基因的引物对与探针；其中，针对金黄色葡萄球菌Nuc基因的上游引物为序列如SEQ ID NO：1所示的Nuc
‑
F，下游引物为序列如SEQ ID NO：2所示的Nuc
‑
R，探针为序列如SEQ ID NO：3所示的Nuc
‑
P；针对沙门氏菌invA基因的上游引物为序列如SEQ ID NO：4所示的invA
‑
F，下游引物为序列如SEQ ID NO：5所示的invA
‑
R，探针为序列如SEQ ID NO：6所示的invA
‑
P；针对单核增生李斯特菌Hly基因的上游引物为序列如SEQ ID NO：7所示的Hly
‑
F，下游引物为序列如SEQ ID NO：8所示的Hly
‑
R，探针为序列如SEQ ID NO：9所示的Hly
‑
P；针对大肠杆菌O157:H7rfbE基因的上游引物为序列如SEQ ID NO：10所示的rfbE
‑
F，下游引物为序列如SEQ ID NO：11所示的rfbE
‑
R，探针为序列如SEQ ID NO：12所示的rfbE
‑
P。
[0006]作为对上述方案的进一步优化，所述金黄色葡萄球菌Nuc基因的探针序列5
’
端修饰有TexRed，所述沙门氏菌invA基因的探针序列5
’
端修饰有Cy5，所述单核增生李斯特菌 Hly基因的探针序列5
’
端修饰有HEX，所述大肠杆菌O157:H7rfbE基因的探针序列5
’
端修饰有FAM；所有探针的3
’
端均修饰有BHQ1。
[0007]本专利技术还提供一种同时检测四种致病菌的多重实时荧光定量PCR方法，包括以下步骤：步骤一、提取待测样本的基因组DNA备用；步骤二、将待测样本的基因组DNA作为模板加入到多重荧光定量PCR反应体系中，所述体系包含上述的引物探针组；步骤三、将步骤二所述反应体系放置于荧光定量PCR仪中进行扩增，收集PCR扩增过程中的荧光信号，通过荧光信号分析判断是否存在致病菌。
[0008]本专利技术另外提供一种同时检测四种致病菌的多重实时荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应液，所述反应液中含有上述的引物探针组。
[0009]作为对上述试剂盒的进一步优化，所述反应液包含反应液A和反应液B；所述反应液A为2
×
PCR Mix，包含的组分为：Taq酶4
‑
8U、dNTP 500nM、pH8.3的Tris
‑
HCL 200mM、 KCL 800mM和Mg
2+
10mM；所述反应液B的组分为：四种致病菌的引物Nuc
‑
F、Nuc
‑
R、 invA
‑
F、invA
‑
R、Hly
‑
F、Hly
‑
R、rfbE
‑
F、rfbE
‑
R各500nM与探针Nuc
‑
P、invA
‑
P、Hly
‑
P、rfbE
‑
P各400nM。
[0010]作为对上述试剂盒的进一步优化，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；所述阴性质控品为DEPC水，所述阳性质控品为根据金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7目的基因构建的质粒按照1:1:1:1比例的混合物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.同时检测四种致病菌的多重荧光定量PCR引物探针组，其特征在于：所述探针引物组包含分别针对金黄色葡萄球菌Nuc基因、沙门氏菌invA基因、单核增生李斯特菌Hly基因和大肠杆菌O157:H7rfbE基因的引物对与探针；其中，针对金黄色葡萄球菌Nuc基因的上游引物为序列如SEQ ID NO：1所示的Nuc
‑
F，下游引物为序列如SEQ ID NO：2所示的Nuc
‑
R，探针为序列如SEQ ID NO：3所示的Nuc
‑
P；针对沙门氏菌invA基因的上游引物为序列如SEQ ID NO：4所示的invA
‑
F，下游引物为序列如SEQ ID NO：5所示的invA
‑
R，探针为序列如SEQ ID NO：6所示的invA
‑
P；针对单核增生李斯特菌Hly基因的上游引物为序列如SEQ ID NO：7所示的Hly
‑
F，下游引物为序列如SEQ ID NO：8所示的Hly
‑
R，探针为序列如SEQ ID NO：9所示的Hly
‑
P；针对大肠杆菌O157:H7rfbE基因的上游引物为序列如SEQ ID NO：10所示的rfbE
‑
F，下游引物为序列如SEQ ID NO：11所示的rfbE
‑
R，探针为序列如SEQ ID NO：12所示的rfbE
‑
P。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于：所述金黄色葡萄球菌Nuc基因的探针序列5
’
端修饰有TexRed，所述沙门氏菌invA基因的探针序列5
’
端修饰有Cy5，所述单核增生李斯特菌Hly基因的探针序列5
’
端修饰有HEX，所述大肠杆菌O157:H7rfbE基因的探针序列5
’
端修饰有FAM；所有探针的3
’
端均修饰有BHQ1。3.一种同时检测四种致病菌的多重实时荧光定量PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、提取待测样本的基因组DNA备用；步骤二、将待测样本的基因组DNA作为模板加入到多重荧光定量PCR反应体系中，所述体系包含权利要求2所述的引物探针组；步骤三、将步骤二所述反应体系放置于荧光定量PCR仪中进行扩增，收集PCR扩增过程中的荧光信号，通过荧光信号分析判断是否存在致病菌。4.一种同时检测四种致病菌的多重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括PCR反应液，所述反应液中含有权利要求2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李猛，宁静，王震光，
申请(专利权)人：洛阳吉恩特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：