一种布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒，由布鲁氏菌属特异性引物1、布鲁氏菌属特异性引物2、布鲁氏菌特异性探针、RealTimePCRMix、模板DNA、阳性对照品、超纯水。本发明专利技术采用实时荧光定量PCR技术，能够针对土壤、水源、血液、粪便、尿液等环境样本进行采集检测，且能够定量检测出布鲁氏菌的拷贝数，具有较高的准确性和特异性；利用该试剂盒配合国家综合性消防救援队的NBC侦检车，可以有效的在生物恐怖袭击现场发挥作用。有效的在生物恐怖袭击现场发挥作用。有效的在生物恐怖袭击现场发挥作用。

【技术实现步骤摘要】
一种布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，特别是一种布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测方 法及试剂盒。

技术介绍

[0002]布鲁氏菌病会造成严重的并发症甚至有死亡危险，因此快速精准的检测布 鲁氏菌，及时进行应急处理，保障公共安全显得尤为重要。消防法第46条规定， 国家综合性消防救援队、专职消防队参加火灾以外的其他重大灾害事故的应急 救援工作。火灾以外的其他重大灾害事故包括恐怖事件和群众遇险事件的救援 工作。目前消防主要依靠核生化NBC侦检车进行病菌检测，对外部的生物和化 学污染物进行取样检测，经过对样品进行杂质分离、杀菌，形成DNA样本，再 利用生物快速检测仪确认有害物质的类别。但长期以来，消防救援队伍在应对 恐怖袭击尤其是生物恐怖方面还存在一些不足，主要表现为：对生物恐怖袭击 的认识不足，对应对生物恐怖的侦检、防护及处置缺乏培训。NBC侦检车配备的 材料和仪器全部需要进口获得，日常维护以及使用不仅操作难度大，检测时间 长，而且成本高。为了提高针对布鲁氏菌检测的准确性、时效性以及可操作性， 尽可能降低检测成本，进一步提升消防救援队伍应对布鲁氏菌生物恐怖袭击的 能力，进行检测方法的研究。
[0003]
技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是要为了提高针对布鲁氏菌检测的准确性、时效性以及可操 作性，尽可能降低检测成本，提供一种布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测方法及 试剂盒。
[0005]为达到上述目的，本专利技术是按照以下技术方案实施的：
[0006]本专利技术的第一个目的是要提供一种布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测试剂 盒，由以下组分组成：
[0007]组成成分布鲁氏菌属特异性引物1布鲁氏菌属特异性引物2布鲁氏菌特异性探针RealTimePCRMix模板DNA阳性对照品超纯水
[0008]；其中布鲁氏菌属特异性引物1、布鲁氏菌属特异性引物2及布鲁氏菌特异 性探针的序列为：
[0009][0010][0011]进一步地，所述阳性对照品为布鲁氏菌活疫苗中提取的布鲁氏菌质粒。
[0012]进一步地，所述模板DNA为布鲁氏菌活疫苗中提取的布鲁氏菌质粒。
[0013]进一步地，提取布鲁氏菌质粒具体方法为：
[0014]使用艾德莱公司生产的高纯质粒小量快速提取试剂盒提取布鲁氏菌灭火疫苗中的布鲁氏菌质粒：
[0015](1)使用前将试剂盒中的RNaseA加入P1溶液中，使P1的浓度为100ug/ml，并在去蛋白液PE和漂洗液WB瓶中加入指定量的无水乙醇；
[0016](2)柱平衡步骤：将新的硅胶膜吸附柱放到收集管中，用移液枪吸取100μL的平衡液到吸附柱中，13000rpm离心1min，离心后倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
[0017](3)用药勺取微量布鲁氏菌灭火疫苗干粉至2ml离心管中，用移液枪吸取250μL溶液P1加入离心管，涡旋振荡直至菌体悬浮；
[0018](4)用移液枪吸取250μL溶液P2加入离心管中，温和地上下翻转6
‑
8次使菌体充分裂解，室温放置4分钟；
[0019](5)用移液枪吸取350μL溶液P3加入离心管中，立即温和地上下翻转6
‑
8次，充分混匀出现白色絮状沉淀；13000rpm离心10min，此时在离心管底部形成沉淀，收集上清液；
[0020](6)将步骤(5)收集的上清液加入经过预平衡处理的吸附柱AC中，12000rpm离心30
‑
60s，倒掉废液；
[0021](7)用移液枪吸取500μL去蛋白液PE至吸附柱中，12000rpm离心30s，倒掉废液；
[0022](8)用移液枪吸取600μL漂洗液WB至吸附柱中，12000rpm离心30s，倒掉废液；
[0023](9)重复步骤(8)；
[0024](10)倒掉废液后，将吸附柱放回空收集管中，12000rpm离心2min，去除漂洗液；
[0025](11)将吸附柱AC放置到一个新的离心管中，用移液枪吸取50μL洗脱缓冲液EB，提前将洗脱液放到水浴锅中加热至65
‑
70℃，室温放置2min，12000rpm离心1min，获得布鲁氏菌质粒。
[0026]本专利技术的第一个目的是要提供一种布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测方法，，包括以下步骤：
[0027](1)确定阳性对照品、布鲁氏菌待测样本、阴性对照样本；
[0028](2)使用艾德莱公司生产的高纯质粒小量快速提取试剂盒提取布鲁氏菌灭火疫苗中的布鲁氏菌质粒，并测定布鲁氏菌质粒的浓度，然后建立布鲁氏菌质粒的标准曲线；
[0029](3)使用移液器吸取布鲁氏菌属特异性引物1、布鲁氏菌属特异性引物2及布鲁氏菌特异性探针各0.50μL，0.5μL模板DNA，10.0μLRealTimePCRMix，8μLddH2O至2mL的离心
管中形成PCR反应体系；
[0030](4)将配制好的PCR反应体系使用离心管3000rpm下震荡30s混匀；
[0031](5)取出荧光定量PCR专用8联管；
[0032](6)使用移液器在8联管每个管中滴加19.5μL的PCR反应体系；
[0033](7)将处理好的布鲁氏菌待测样本在每个管滴加0.5μL；
[0034](8)对荧光定量PCR专用8联管加盖，并用刮板刮平；
[0035](9)将荧光定量PCR专用8联管放入离心机中，3000rpm离心15s；
[0036](10)将离心好的荧光定量PCR专用8联管装入PCR仪器中，设定程序进行检测，循环参数设置为：样品体积为20μL，热盖温度选择105℃，运行模式选择模拟管，95℃5min，循环1次；95℃15s，60℃60s，此步骤后采集荧光信号，循环40次；按照步骤进行实施荧光定量PCR检测之后，得到扩增曲线和Ct值；
[0037](11)根据Ct值进行检测结果判断：
[0038][0039]；(12)将Ct值代入公式y＝
‑
0.3031x+11.037，得到待检测样本的拷贝数。
[0040]进一步地，所述步骤(2)中建立布鲁氏菌质粒的标准曲线具体包括：
[0041](201)拷贝数计算：利用超微量分光光度计检测质粒浓度，按照以下公式计算质粒的拷贝数：拷贝数(copies/μL)＝6.02
×
10
23
(copies/mol)
×
质粒浓度(ng/μL)
×
10
－9
/[(载体分子量+插入片段分子量)
×
660](g/mol)，则得出质粒拷贝数；
[0042](202)标准质粒稀释：将布鲁氏菌质粒用双蒸水按照10倍的梯度进行稀释，分别稀释为100，10
‑1，10
‑2，10
‑3，10
‑4，10
‑5ng/μ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：组成成分布鲁氏菌属特异性引物1布鲁氏菌属特异性引物2布鲁氏菌特异性探针RealTimePCRMix模板DNA阳性对照品超纯水其中布鲁氏菌属特异性引物1、布鲁氏菌属特异性引物2及布鲁氏菌特异性探针的序列为：2.根据权利要求1所述的布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为布鲁氏菌活疫苗中提取的布鲁氏菌质粒。3.根据权利要求1所述的布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述模板DNA为布鲁氏菌活疫苗中提取的布鲁氏菌质粒。4.根据权利要求2或3所述的布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，提取布鲁氏菌质粒具体方法为：使用艾德莱公司生产的高纯质粒小量快速提取试剂盒提取布鲁氏菌质粒：(1)使用前将试剂盒中的RNaseA加入P1溶液中，使P1的浓度为100ug/ml，并在去蛋白液PE和漂洗液WB瓶中加入指定量的无水乙醇；(2)柱平衡步骤：将新的硅胶膜吸附柱放到收集管中，用移液枪吸取100μL的平衡液到吸附柱中，13000rpm离心1min，离心后倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；(3)用药勺取微量布鲁氏菌灭火疫苗干粉至2ml离心管中，用移液枪吸取250μL溶液P1加入离心管，涡旋振荡直至菌体悬浮；(4)用移液枪吸取250μL溶液P2加入离心管中，温和地上下翻转6
‑
8次使菌体充分裂解，室温放置4分钟；(5)用移液枪吸取350μL溶液P3加入离心管中，立即温和地上下翻转6
‑
8次，充分混匀出现白色絮状沉淀；13000rpm离心10min，此时在离心管底部形成沉淀，收集上清液；(6)将步骤(5)收集的上清液加入经过预平衡处理的吸附柱AC中，12000rpm离心30
‑
60s，倒掉废液；(7)用移液枪吸取500μL去蛋白液PE至吸附柱中，12000rpm离心30s，倒掉废液；
(8)用移液枪吸取600μL漂洗液WB至吸附柱中，12000rpm离心30s，倒掉废液；(9)重复步骤(8)；(10)倒掉废液后，将吸附柱放回空收集管中，12000rpm离心2min，去除漂洗液；(11)将吸附柱AC放置到一个新的离心管中，用移液枪吸取50μL洗脱缓冲液EB，提前将洗脱液放到水浴锅中加热至65
‑
70℃，室温放置2min，12000rpm离心1min，获得布鲁氏菌质粒。5.一种布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)确定阳性对照品、布鲁氏菌待测样本、阴性对照样本；(2)使用艾德莱公司生产的高纯质粒小量快速提取试剂盒提取布鲁氏菌灭火疫苗中的布鲁氏菌质粒，并测定布鲁氏菌质粒的浓度，然后建立布鲁氏菌质粒的标准曲线；(3)使用移液器吸取布鲁氏菌属特异性引物1、布鲁氏菌属特异性引物2及布鲁氏菌特异性探针各0.50μL...

【专利技术属性】
技术研发人员：王慧飞，张立安，王志刚，孙科，侯亚欣，
申请(专利权)人：中国人民警察大学，
类型：发明
国别省市：