闭管可视化检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种闭管可视化检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的试剂盒及方法，根据鮰爱德华氏菌保守蛋白中的假设蛋白epi18设计引物，在反应体系中通过pH敏感的指示剂，可实现闭管可视化判定靶标基因的目的，该试剂盒检测灵敏度高，DNA最低检出率为7.9 copies/μL，特异性强，检测结果清晰明显，肉眼观察即可判断；也可直接从病鱼脑组织直接提取DNA进行快速检测，相较于原始检测方法，速度快、可视化程度高，具有良好野外及资源有限的基层实验室检测应用的前景。的前景。

【技术实现步骤摘要】
闭管可视化检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于分子检测
，具体涉及闭管可视化检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]斑马鱼是国际上应用于科学研究最广的实验鱼类，其健康状况和质量是开展一切与斑马鱼相关研究工作的基础。在斑马鱼室内养殖过程中，各类细菌性疾病的爆发，严重制约了以斑马鱼为基础的相关研究工作的进展。据报道鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)是一种斑马鱼鱼房内危害比较严重的细菌性病原，一旦在斑马鱼实验室内爆发，传播迅速，死亡率高达50％，造成损失巨大，感染存活下来的斑马鱼依旧可以携带病原，其粪便经健康鱼吞食，或者通过摄食已感染鱼尸体而传染给其它健康鱼类造成第二次该类鱼病爆发。病鱼常表现为鱼腹部膨大，口腔、下颌、眼眶、鳃盖、肛门及鳍条基部等部位明显充血、出血，头顶正中部位皮下发红，头背部颅侧皮肤坏死、溃烂，病情严重的头骨裂开暴露脑组织等症状。
[0003]目前，鮰爱德华氏菌的检测方法有常规的分离培养(分离培养需要至少2天时间)、生理生化鉴定，聚合酶链式反应以及16S rDNA测序等。常规方法具有检测时间长、耗时耗力等缺点；酶联免疫检测方法(ELISA)可以快速检测细菌，但必需先制备相关抗体，步骤繁琐耗时。PCR技术具有灵敏、特异、快速等优点，广泛应用于水产养殖病原的检测中。但PCR技术对实验人员和环境的要求高，仪器设备贵、操作步骤多。与一般PCR技术相比，荧光PCR检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。但实时荧光PCR仪器设备昂贵，无法用于现场检测。因此，建立快速、准确、灵敏的检测鮰爱德华氏菌的新方法，对于疾病的早期诊断和预警、实时监测，及时治疗具有重要的意义。
[0004]环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由Notomi T等人专利技术的新型核酸扩增技术(PMID:10871386)。该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在61
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65℃的恒温条件下完成反应，避免了类似PCR扩增的变性、退火、延伸等多温度变化过程，极大地降低了反应设备的生产成本；同时其仍能保留等同于PCR技术的高灵敏度和特异性等优点，在快速检测领域展示出了巨大的活力。近年来，国内外已将该技术广泛应用于病原体检测。
[0005]目前，在其它物种分离的鮰爱德华氏菌检测中，国外Yeh等已有关于LAMP技术的报道(PMID:16157211)。然而经我们实践检测发现上述报道所用引物在斑马鱼源鮰爱德华氏菌检测中并不工作，且对LAMP结果判定，主要通过琼脂糖电泳实现，而LAMP扩增产物产量巨大，在开盖检测过程极易产生气溶胶等污染问题导致假阳性结果的出现。2015年有研究报道，在核酸等温扩增反应过程中，伴随着靶基因扩增产物的积累过程中，产生了大量的H
+
，使反应体系pH下降(PMID:25652028)。因此，可以利用pH敏感的指示剂通过颜色变化以判断LAMP反应是否发生，从而实现闭管可视化结果判定的目的。目前，尚未见pH指示剂应用于斑马鱼源鮰爱德华氏菌LAMP检测的相关报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种闭管可视化检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的试剂盒及方法，根据鮰爱德华氏菌保守蛋白中的假设蛋白epi18设计设计引物，在反应体系中添加了pH指示剂，可实现闭管可视化判定靶标基因的目的。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]用于检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的LAMP引物组合：外引物序列如SEQ ID NO.1和2所示，内引物序列如SEQ ID NO.3和4所示。
[0009]检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的试剂盒，包括序列如SEQ ID NO.1和2所示的外引物，序列如SEQ ID NO.3和4所示的内引物。
[0010]优选地，外引物与内引物的浓度比1：4
‑
8。
[0011]优选地，上述试剂盒还包括LAMP反应预混液(含pH指示剂)，阳性质粒，所述的阳性质粒为含有鮰爱德华氏菌epi18基因的质粒。
[0012]与现有技术相比，本专利技术具有以下技术效果：
[0013]1、本专利技术建立的斑马鱼源鮰爱德华氏菌LAMP检测方法特异性强，所用的特异性引物根据文献报道的鮰爱德华氏菌保守蛋白中的假设蛋白epi18设计，且在反应体系中添加了pH指示剂，以达到闭管可视化判定靶基因是否被有效扩增的效果，可有效避免利用琼脂糖凝胶电泳、荧光染料等方法引起的假阳性问题。
[0014]2、本专利技术检测灵敏度高，基因组DNA最低检出率为7.9copies/μL；检测时间短，扩增反应只需60min；可以直接从病鱼脑组织DNA中直接检出鮰爱德华氏菌病原，从样品基因组DNA的提取到完成结果判断，整个检测流程仅需70min，比常规分离培养病原，提取病原基因组DNA，再进行PCR等分子或生理生化方法对病原进行确认缩短超过2天时间，大幅度提高检测速度；仪器设备要求低，无需常规PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统等，只需一个水浴锅就可完成检测，操作简单，结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，稍具分子生物学基础的人员即可完成操作，检测结果清晰明显，肉眼观察即可判断，具有良好野外及资源有限的基层实验室检测应用的前景。
附图说明
[0015]图1为实施例1中样品检测结果。1为待检样品，2为阳性对照组，3为阴性对照组。
[0016]图2为实施例2中灵敏度检测结果。1～6分别是10倍稀释的基因组模板，对应的模板中靶基因epi18拷贝数分别为7.9
×
105、7.9
×
104、7.9
×
103、7.9
×
102、7.9
×
101、7.9
×
100(copy/μL)，7为阴性对照。
[0017]图3为实施案例3中采用文献提供检测鮰爱德华氏菌引物电泳方法检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌结果。1为DL2000 Marker，2为斑马鱼源鮰爱德华氏菌，3为阴性对照。
[0018]图4为实施案例3中采用文献提供检测鮰爱德华氏菌引物可视化检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌结果。1为斑马鱼源鮰爱德华氏菌，2为阴性对照。
[0019]图5为实施例3中特异性检测结果。1～6分别为鮰爱德华氏菌、类志贺氏菌、弧菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、大肠杆菌，标记7为阴性对照。
[0020]图6为实施例4中斑马鱼病鱼脑组织中病原物的LAMP检测结果。1
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4分别为病原脑组织DNA模板、阳性鮰爱德华氏菌DNA模板、健康鱼脑组织DNA模板、无菌水模板。
具体实施方式
[0021]实施例1：LAMP技术检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的方法的建立
[0022](1)LAMP引物设计：根据文献报道的鮰爱德华氏菌的保守蛋白epi18基因在NCBI中查找其编码序列设计外引物为F3a本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的LAMP引物组合，其特征在于，外引物序列如SEQ ID NO.1和2所示，内引物序列如SEQ ID NO.3和4所示。2.检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合。3.根据权利要求2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳力月，孙永华，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：