基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组及其检测方法技术

本发明专利技术提供了一种基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组及其检测方法，该检测探针组包括发夹型探针H1、发夹型探针H2、信号链S3和Pb

【技术实现步骤摘要】
基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组及其检测方法


[0001]本专利技术涉及生物分析检测
，具体涉及一种基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组及其检测方法。

技术介绍

[0002]牛结核病主要是由牛结核分枝杆菌引起的是一种人畜共患病，该病确诊需要病原分离与鉴定。目前，鉴定牛结核分枝杆菌的方法主要有微生物培养、免疫学方法、分子检测等。前两种诊断方法虽然可以检测牛结核分枝杆菌感染，但它们对亚临床或潜伏期感染的敏感度和特异性较低、微生物培养还存在孵育时间长和检测工作量大的问题。分子检测中，常用实时荧光定量PCR进行检测。实时荧光定量PCR要求使用荧光报告基团，目前实时荧光定量PCR常用的荧光标记如，SYBR Green I、Tapman探针、分子信标等，但都存在一定的缺点：SYBR Green I对引物要求高且易出现非特异性条带；Tapman探针虽特异性高但价格高昂；分子信标虽特异性好但仅适用于特定目标。实时荧光定量PCR还需要用到荧光定量PCR仪，这增加了检测的成本，不适用于普通场所。因此为了提高检测对特异性、灵敏度的要求，同时降低检测成本和降低对大型设备的依赖性，核酸层面的快检技术成为现阶段的发展趋势。
[0003]8‑
17 DNAzyme是一种具有DNA切割活性的核酸酶，能催化一系列化学反应，它比RNA和蛋白质更容易操作，并在不对称催化、生物传感器、DNA纳米技术以及临床诊断方面得到了广泛的应用。2000年，美国伊利诺伊大学香槟分校的Lu教授等人筛选出对铅离子具有高度亲和力、能特异性结合的8
‑
17DNAzyme。专利CN201510895100.X公开了一种固相检测技术用于环境中Pb
2+
的检测方法，利用固定在芯片表面的探针捕获断裂后释放到溶液中的带荧光标记的部分底物链，借助于发射波激发捕获的底物链，建立荧光信号与Pb
2+
浓度的关系。同样地，另一公开的专利(CN201810857689.8)利用这一特点与核酸外切酶Ⅲ构建了目标信号级联放大的扩增策略用于检测环境中Pb
2+
。迄今为止，已经构建了许多基于HCR的DNAzyme生物传感器用于检测核酸、癌细胞、蛋白质、代谢物和金属离子。但是，受限于金属离子，基于8
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17 DNAzyme构建的体内检测体系不能安全地实施。
[0004]因此，为了提高检测对特异性、灵敏度的要求，核酸层面的快检技术成为现阶段的发展趋势，但大多数核酸检测策略是基于聚合酶链式反应(PCR)，有易污染、成本高、序列错配、需要高度纯化的核酸样品才能维持聚合酶的活性等缺点，开发一种基于8
‑
17 DNAzyme构建体外检测体系用于对牛结核分枝杆菌特异性DNA序列具有重要意义。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提出了一种基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组及其检测方法，通过设计一种依赖Pb
2+
催化的8
‑
17 DNAzyme双循环体系，实现牛结核分枝杆菌特异性DNA序列的体外快速检测，该双循环体系能够显著提高牛结核分
枝杆菌的体外检测灵敏度和特异性。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术首先提供了一种基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组，包括发夹型探针H1、发夹型探针H2、信号链S3和Pb
2+
；
[0007]所述发夹型探针H1和发夹型探针H2均为茎环结构，所述发夹型探针H1和发夹型探针H2均含有8
‑
17 DNAzyme碱基序列，所述发夹型探针H1环部区中心位置和信号链S3中心位置均有8
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17 DNAzyme特异性切割位点；
[0008]所述发夹型探针H1的游离3
’
端和环部区分别连接有a1区和b1区，所述a1区和b1区分别为与牛结核分枝杆菌靶序列5
’
端和3
’
端互补的碱基序列，所述发夹型探针H1环部区还包含有引发链序列；
[0009]所述发夹型探针H2的环部区包含有与所述引发链互补的碱基序列，所述发夹型探针H2的游离3
’
端和茎部互补区分别连接有a2区和b2区，所述a2区和b2区分别为与所述信号链S3的5
’
端和3
’
端互补的碱基序列；
[0010]所述信号链S3的两端分别连接有荧光基团和荧光淬灭基团。
[0011]作为优选，所述a1区基因序列如SEQ ID NO.1所示：GTCTGCACA；所述b1区基因序列如SEQ ID NO.2所示：TAGTCCTCT。
[0012]作为优选，所述a2区基因序列如SEQ ID NO.3所示：AACTAAGA；所述b2区基因序列如SEQ ID NO.4所示：GAACTATCT。
[0013]作为优选，所述发夹型探针H1的基因序列如SEQ ID NO.5所示：GGATCAAAAATAGTCCTCTACTrAGTCTTTTTTTTTGATCCGAGCCGGACGAAGTGTCTGCACA，该序列中rA为RNA碱基，为特异性切割位点；
[0014]所述牛结核分枝杆菌靶序列的基因序列如SEQ ID NO.8所示：TGTGCAGACGGAGAGGACTAGATTTGTCAGA。
[0015]作为优选，所述发夹型探针H2的基因序列如SEQ ID NO.6所示：GGAGATAGTTCAGTAGAGGACTATTTTTGATAAGAACTATCTCCGAGCCGGACGAAACTAAGA；
[0016]所述信号链S3的基因序列如SEQ ID NO.7所示：TCTTAGTTrAGGATAGTT，该序列中rA为RNA碱基，为特异性切割位点。
[0017]作为优选，所述荧光基团为FAM基团，所述荧光淬灭基团为BHQ基团。
[0018]基于一个总的专利技术构思，本专利技术还提供了一种基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组的检测方法，包括以下步骤：
[0019]S1、探针序列预处理：将探针H1、H2和信号链S3的冻干粉用缓冲溶液溶解，然后对探针H1、H2进行退火以形成茎环结构；
[0020]S2、双循环体系反应：取步骤S1中的缓冲溶液、退火后的探针H1、H2溶液与待检测样品混合加入EP管中混合均匀，然后避光加入信号链S3溶液混合反应，一步构建双循环反应体系；
[0021]S3、荧光值测定：将步骤S2混合反应液在黑暗条件下用荧光计进行检测，并记录下荧光值，通过荧光值判断待检测物是否含有牛结核分枝杆菌；
[0022]所述缓冲溶液含有Pb
2+
。
[0023]作为优选，所述缓冲液包括Tris
‑
HCl、NaCl和PbCl2。
[0024]作为优选，所述步骤S1中退火温度设置为:95℃,5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组，其特征在于，包括发夹型探针H1、发夹型探针H2、信号链S3和Pb
2+
；所述发夹型探针H1和发夹型探针H2均为茎环结构，所述发夹型探针H1和发夹型探针H2均含有8
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17DNAzyme碱基序列，所述发夹型探针H1环部区中心位置和信号链S3中心位置均有8
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17DNAzyme特异性切割位点；所述发夹型探针H1的茎部区游离3
’
端和环部区分别连接有a1区和b1区，所述a1区和b1区分别为与牛结核分枝杆菌靶序列5
’
端和3
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端互补的碱基序列，所述发夹型探针H1还包含有引发链序列；所述发夹型探针H2的环部区包含有与所述引发链互补的碱基序列，所述发夹型探针H2的游离3
’
端和茎部互补区分别连接有a2区和b2区，所述a2区和b2区分别为与所述信号链S3的5
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端和3
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端互补的碱基序列；所述信号链S3的两端分别连接有荧光基团和荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组，其特征在于，所述a1区基因序列如SEQ ID NO.1所示：GTCTGCACA；所述b1区基因序列如SEQ ID NO.2所示：TAGTCCTCT。3.根据权利要求1所述的基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组，其特征在于，所述a2区基因序列如SEQ ID NO.3所示：AACTAAGA；所述b2区基因序列如SEQ ID NO.4所示：GAACTATCT。4.根据权利要求1所述的基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组，其特征在于，所述发夹型探针H1的基因序列如SEQ ID NO.5所示：GGATCAAAAATAGTCCTCTACTrAGTCTTTTTTTTTGATCCGAGCCGGACGAAGTGTCTGCACA，该序列中rA为RNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张何，杨苑，杨梅，张培柔，傅昕，
申请(专利权)人：湖南工程学院，
类型：发明
国别省市：