一种快速、灵敏检测副鸡禽杆菌核酸的横向流动检测试剂、方法技术

本发明专利技术提供了一种快速、灵敏检测副鸡禽杆菌核酸的横向流动检测试剂、方法。提供了一种快速、灵敏检测副鸡禽杆菌核酸的引物，其包括如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的序列或反向序列，利用该引物进行扩增后并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳或试纸条进行检测。本发明专利技术提供的方法能快速、准确地测定副鸡禽杆菌的核酸。准确地测定副鸡禽杆菌的核酸。

【技术实现步骤摘要】
一种快速、灵敏检测副鸡禽杆菌核酸的横向流动检测试剂、方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种快速、灵敏检测副鸡禽杆 菌核酸的新型横向流动检测试剂、方法。

技术介绍

[0002]鸡传染性鼻炎是由副鸡禽杆菌引起的一种鸡急性上呼吸道传染病。目前 该病在世界许多地方都有发生和流行，给养禽业造成很大的经济损失。根据 Page和Kume血清分型方案，可将副鸡禽杆菌分为3个血清群(A、B、C)和 9个血清型(A1
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A4、B
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1和C1
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C4)。该病最常见的临床特征是打喷嚏、眶下 窦肿胀、面部水肿及结膜炎、鼻分泌物，并伴有生长迟缓和产蛋量减少，这 与养禽业的经济效益密切相关。因此，急需开发可靠的检测工具以便于在感 染早期进行诊断干预，从而减少经济损失。
[0003]目前，已有较多的副鸡禽杆菌的检测方法，如ELISA等血清学检测方 法以及传统PCR和实时荧光定量PCR等核酸检测方法。然而，一些技术困 难和挑战阻碍了这些方法的广泛使用。例如，虽然ELISA是一种众所周知的 高通量细菌检测技术，但它也有一些缺点，包括需要高度特异性和敏感性的 抗体、耗时、繁琐的洗涤和培养步骤。因此，该方法不能被认为是一种广泛 应用于副鸡禽杆菌的有效方法。
[0004]与常规血清学检测相比，核酸检测技术具有灵敏度高、特异性强的特点， 在缩短检测时间、提高病原体检出率方面具有较大的优势。目前常用的核酸 检测技术是传统PCR，该技术获得的扩增产物是根据特定条带的大小通过琼 脂糖凝胶电泳初步确定的。然而，一些缺陷也制约了传统PCR方法的进一步 应用。例如耗时、繁琐、容易产生污染。随着分子生物学技术的不断发展， 各种基于PCR的技术不断发展，尤其是RT
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qPCR的专利技术，为整个分子诊断 行业带来了新的活力。该技术具有灵敏度和特异性高的特点，同时需要完善 的基础设施和经验丰富的操作人员，因此该方法难以推广。因此，开发一种 新型的、灵敏、快速、低成本、高通量的副鸡禽杆菌核酸检测技术用于副鸡 禽杆菌的早期诊断，对于控制其进一步传播具有重要意义。
[0005]横向流动分析(LFA)是一种快速、灵敏的检测方法，具有分析成本低、 快速、灵敏、操作简单、不需要复杂的基础设施和经验丰富的操作人员等优 点，已广泛应用于各个领域。作为一种新型的免疫标记技术，纳米金颗粒在 该技术中常用作为应用于抗原和抗体的微量标记物。通过设计夹层结构的 LFA条带，LFA方法在病毒、细菌、寄生虫抗原、小分子药物等检测中具有 重要的应用价值。例如，它可以用来评估不同样品中的毒素，而无需繁琐的 操作。在禽类病原体方面，该方法可以检测流感病毒、新城疫病毒、禽白血 病病毒等。但这些例子大多以抗体检测或小分子检测为主，基于LFA的核酸 检测还需要进一步发展和完善。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种快速、灵敏检测副鸡禽杆菌核 酸的引物及方法。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：
[0008]一种快速、灵敏检测副鸡禽杆菌核酸的引物，其包括如SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO.2所示的序列或反向序列。
[0009]一种快速、灵敏检测副鸡禽杆菌核酸的横向流动检测试剂，其包括用于 检测副鸡禽杆菌核酸的引物及检测条，其中，SEQ ID NO.1所示序列的5
′
端 标记生物素，SEQ ID NO.2所示序列的5
′
端标记地高辛，所述检测条包括次 序叠加组装在垫板上的样品垫、共轭垫、硝酸硝酸纤维素膜和吸收垫，其中， 硝酸硝酸纤维素膜上的检测线包被有山羊抗生物素抗体，质控线包被有山羊 抗小鼠IgG抗体，共轭垫上包被有小鼠抗地高辛抗体偶联的纳米金抗体偶联 物。
[0010]如上所述的检测试剂，优选地，所述检测线包被山羊抗生物素抗体的浓 度为1mg/mL，所述质控线包被有山羊抗小鼠IgG抗体的浓度为2mg/mL。
[0011]如上所述的检测试剂，优选地，所述纳米金抗体偶联物的制备方法，包 括采用柠檬酸三钠法制备的纳米金颗粒，用碳酸钾调节纳米金颗粒溶液的pH 值，加入小鼠抗地高辛抗体进行标记，之后再加入20％BSA进行封闭，搅 拌后，离心获得纳米金抗体偶联物，加入偶联稀释缓冲液进行重悬。
[0012]进一步地，所述纳米金颗粒的粒径为25nm，pH值为8.0。
[0013]优选地，所述样品垫上包被有3％的BSA。
[0014]一种快速、灵敏检测副鸡禽杆菌核酸的横向流动检测方法，其包括如下 步骤：
[0015](1)提取样品的DNA，
[0016](2)采用引物对如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列对提取的 DNA进行PCR扩增，其中，SEQ ID NO.1所示序列的5
′
端标记生物素，SEQ ID NO.2所示序列的5
′
端标记地高辛；
[0017](3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物用电泳方法或核酸检测条进行结 果判定。
[0018]如上所述的检测方法，优选地，在步骤(2)中，所述PCR扩增的体系 中包括终浓度为1xTaq PCR Mix，引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的浓 度分别为0.2μmol/L。
[0019]如上所述的检测方法，优选地，在步骤(2)中，所述PCR反应条件为： 94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min，35个循环；72℃ 10min.
[0020]如上所述的检测方法，优选地，在步骤(3)中，电泳方法判定结果：若 有507bp的条带说明检测结果为阳性，否则为阴性。
[0021]如上所述的检测方法，优选地，在步骤(3)中，检测条判定结果：当检 测线T线和质控线C线均显色时，说明样品中含副鸡禽杆菌的核酸成分；
[0022]当检测线T线不显色、质控线C线显色时，说明样品中不含副鸡禽杆菌 的核酸；当质控线C线不显色时，说明操作不当应重新检测或试纸条已经失 效。
[0023]如上所述的检测方法，优选地，本专利技术的有益效果在于：
[0024]本专利技术提供的副鸡禽杆菌核酸的引物，用于快速、准确地测定副鸡禽杆 菌的核酸。本专利技术提供的LFA检测方法，采用标记有生物素和地高辛的引物 对进行PCR扩增，将小
鼠抗地高辛抗体的纳米金颗粒作为探针包被在共轭垫 或样品垫上，山羊抗生物素抗体作为检测线，山羊抗小鼠IgG抗体作为质控 线制备LFA检测条，制备的LFA检测条具有较高的敏感性和特异性。本发 明的方法通过实验验证获得LFA在临床传染性鼻炎鸡中副鸡禽杆菌核酸检 测的可靠性和准确性。结果表明，本专利技术提供的快速、灵敏检测副鸡禽杆菌 核酸的横向流动检测试纸条在副鸡禽杆菌核酸检测方面具有重要的临床意 义。
附图说明
[0025]图1为对副鸡禽杆菌PCR扩增褪火温度选择的实验结果。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速、灵敏检测副鸡禽杆菌核酸的引物，其特征在于，其包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列或反向序列。2.一种快速、灵敏检测副鸡禽杆菌核酸的横向流动检测试剂，其特征在于，其包括权利要求1所述的检测副鸡禽杆菌核酸的引物和检测条，其中，SEQ ID NO.1所示序列的5
′
端标记生物素，SEQ ID NO.2所示序列的5
′
端标记地高辛，所述检测条包括次序叠加组装在垫板上的样品垫、共轭垫、硝酸硝酸纤维素膜和吸收垫，其中，所述硝酸纤维素膜上的检测线包被有山羊抗生物素抗体，质控线包被有山羊抗小鼠IgG抗体，共轭垫上包被有小鼠抗地高辛抗体偶联的纳米金抗体偶联物。3.如权利要求2所述的横向流动检测试剂，其特征在于，所述检测线包被的山羊抗生物素抗体的浓度为1mg/mL，所述质控线包被的山羊抗小鼠IgG抗体的浓度为2mg/mL。4.如权利要求3所述的横向流动检测试剂，其特征在于，所述纳米金抗体偶联物的制备方法，包括采用柠檬酸三钠法制备的纳米金颗粒，用碳酸钾调节纳米金颗粒溶液的pH值，加入小鼠抗地高辛抗体进行标记，之后再加入20％BSA进行封闭，搅拌后，离心获得纳米金抗体偶联物，加入偶联稀释缓冲液进行重悬。5.如权利要求4所述的横向流动检测试剂，其特征在于，所述纳米金颗粒的粒径为25nm，pH值为8.0；样品垫上包被有3％的BSA。6.一种快速、灵敏检测副鸡禽杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙惠玲，霍彩云，李桂萍，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：