基于氟代吡啶型化合物的蛋白质-蛋白质偶联方法技术

一种基于氟代吡啶型化合物(5

【技术实现步骤摘要】
基于氟代吡啶型化合物的蛋白质
‑
蛋白质偶联方法


[0001]本专利技术属于蛋白质修饰及蛋白质
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蛋白质偶联领域，具体涉及了一种基于氟代吡啶型化合物的蛋白质
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蛋白质偶联新方法。

技术介绍

[0002]保留蛋白质天然功能的共价修饰，尤其是可以应用于生物大分子偶联的共价修饰，如蛋白质
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蛋白质偶联，一直以来都是化学生物学研究者追求的目标，这对于探索蛋白质结构与功能的关系、开发新的药物疗法以及提供蛋白质合成新路径至关重要。共价修饰的高效性、特异性，产物的均一性往往是衡量蛋白质修饰及偶联的重要标准。
[0003]点击化学(click chemstry)通过叠氮
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炔的环加成反应成功地应用于蛋白质
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蛋白质偶联，该反应特异性高、产物均一(Nat.Protoc.,2015,10:1594～1611)。但是其往往需要将非天然氨基酸插入到蛋白质片段以引入特定官能团，这大大增加了蛋白质偶联的难度，限制了其应用范围。
[0004]α
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酮酸
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羟胺连接(α
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ketoacid
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hydroxylamine ligation)通过α
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酮酸和羟胺之间的脱羧缩合反应进行蛋白质偶联，不需要非天然氨基酸的插入(Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45:1248～1252)。但是蛋白质碳端酮酸及氮端羟胺的引入往往需要借助于肽的化学合成来完成，这大大限制了偶联产物的大小。且反应条件激烈(共溶剂，酸性，60℃)，偶联产物需复性。
[0005]天然化学连接(native chemical ligation)通过蛋白质碳端α
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硫酯和氮端半胱氨酸之间的分子内重排反应将蛋白质进行偶联，反应较快、产率高，且产物通过天然肽键连接(Science,1994,266:776～779)。但是蛋白质中α
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硫酯的引入往往需要额外的化学修饰来完成，硫酯中间体易水解，对偶联产物的均一性有一定影响，且偶联产物需复性。
[0006]表达蛋白连接(expresssed protein ligation)通过Intein融合蛋白的硫解，可在目的蛋白碳端引入α
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硫酯，进而与半胱氨酸反应完成蛋白质
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蛋白质偶联(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1998,95:6705～6710)。但是，硫酯中间体的水解、副反应的发生等问题并没有得到解决。
[0007]肽酰肼的天然化学连接(native chemical ligation of peptide hydrazides)通过以酰肼作为硫酯的替代物，可成功地应用于蛋白质
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蛋白质偶联(Angew.Chem.Int.Ed.,2011,123:7787～7791)。酰肼相对于硫酯而言更加稳定，且更容易通过化学合成方法获得，但是反应过程中激烈的反应条件(NaNO2,pH 3.0,6M Gn
·
HCl)、中间体的水解、产物的复性等问题仍然存在。
[0008]丝氨酸/苏氨酸连接(serine/threonine ligation)可以通过蛋白质碳端水杨醛酯和氮端丝氨酸、苏氨酸之间的成环及分子内重排反应将蛋白质进行偶联(Org.Lett.,2010,12:1724～1727)，但是水杨醛酯的引入同样需要肽的化学合成来完成，且反应条件激烈，产物需要复性。
[0009]除了以上基于化学方法的蛋白质
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蛋白质偶联，基于蛋白质反式剪接
(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1998,95:3543～3548)和酶活性的蛋白质偶联也被广泛应用，如Sortase(Nat.Chem.Biol.,2019,15:276～284)、Butelase 1(Nat.Protoc.,2016,11:1977～1988)、OaAEP1b(J.Am.Chem.Soc.,2017,139:5351～5358)、Subtiligase(Nat.Chem.Biol.,2018,14:50～57)、Trypsiligase(Angew.Chem.,Int.Ed.,2014,53:3024～3028)等酶。这些方法均可基于酶特征的识别及催化活性将蛋白质进行偶联，但是其内在的限制性是不可避免的，如反应的可逆性及中间体产物的水解。

技术实现思路

[0010]本专利技术目的是针对现有方法中存在的上述不足，提供一种基于氟代吡啶型化合物(FPPA)的蛋白质
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蛋白质偶联新方法。本专利技术建立了一种简单、多样性的蛋白质
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蛋白质偶联新方法，旨在为蛋白质偶联化学做出重要补充。
[0011]本专利技术提供的基于氟代吡啶型化合物的蛋白质
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蛋白质偶联方法，包括如下步骤：
[0012](1)称取氟代吡啶型化合物5
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氟
‑4‑
苯砜基
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吡啶甲醛(FPPA)加入到DMF中配制FPPA溶液；其中FPPA结构式如下：
[0013][0014](2)向含半胱氨酸蛋白质1溶液中加入2倍量TCEP，调节pH为7.5，静置；
[0015](3)向步骤(2)的溶液中缓慢加入相对于蛋白质1的2
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4倍量步骤(1)中配制的FPPA溶液，并保证滴加过程及溶液最终pH为7.5，FPPA能够通过氟的离去对蛋白质1进行修饰；
[0016](4)反应完全后，透析反应液，除去多余FPPA和新生成小分子，并将透析后反应液浓缩，得到纯净的蛋白质1
‑
FPPA复合物溶液；
[0017](5)向蛋白质1
‑
FPPA复合物溶液中加入2倍量TECP，1.2倍量含半胱氨酸蛋白质2，调pH为7.5，通过苯砜基的离去即能够完成蛋白质
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蛋白质偶联，将反应液过分子排阻色谱得到纯净的蛋白质1
‑
蛋白质2偶联产物a；
[0018]或者，向蛋白质1
‑
FPPA复合物溶液中加入2倍量TCEP，1倍量含N端半胱氨酸蛋白质3，调pH为6.5，通过醛基和半胱氨酸的环化反应即能够完成蛋白质
‑
蛋白质偶联，将反应液过分子排阻色谱得到纯净的蛋白质1
‑
蛋白质3偶联产物b。
[0019](6)向蛋白质1
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蛋白质2偶联产物a中加入2倍量含有1,2
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氨基硫醇类化合物或者含N端半胱氨酸蛋白质，调溶液pH为6.5，即能够完成三组分多功能生物大分子的构建；
[0020]或者，向蛋白质1
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蛋白质3偶联产物b中加入2倍量含巯基化合物或者含半胱氨酸蛋白质，调溶液pH为7.5，即可完成三组分多功能生物大分子的构建。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于氟代吡啶型化合物的蛋白质
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蛋白质偶联方法，其特征在于包括如下步骤：(1)称取氟代吡啶型化合物5
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氟
‑4‑
苯砜基
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吡啶甲醛(FPPA)加入到DMF中配制FPPA溶液；其中FPPA结构式如下：(2)向含半胱氨酸蛋白质1溶液中加入2倍量还原剂三(2
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羧乙基)膦(TCEP)，调节pH为7.5，静置；(3)向步骤(2)的溶液中缓慢加入相对于蛋白质1的2
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4倍量步骤(1)中配制的FPPA溶液，并保证滴加过程及溶液最终pH为7.5，FPPA能够通过氟的离去对蛋白质1进行修饰；(4)反应完全后，透析反应液，除去多余FPPA和新生成小分子，并将透析后反应液浓缩，得到纯净的蛋白质1
‑
FPPA复合物溶液；(5)向蛋白质1
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FPPA复合物溶液中加入2倍量TECP，1.2倍量含半胱氨酸蛋白质2，调pH为7.5，通过苯砜基的离去即能够完成蛋白质
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蛋白质偶联，将反应液过分子排阻色谱得到纯净的蛋白质1
‑
蛋白质2偶联产物a；或者，向蛋白质1
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FPPA复合物溶液中加入2倍量TCEP，1倍量含N端半胱氨酸蛋白质3，调pH为6.5，通过醛基和半胱氨酸的环化反应即能够完成蛋白质
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蛋白质偶联，将反应液过分子排阻色谱得到纯净的蛋白质1
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蛋白质3偶联产物b。2.根据权利要求1所述基于氟代吡啶型化合物的蛋白质
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蛋白质偶联方法，其特征在于，还包括：(6)向蛋白质1
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【专利技术属性】
技术研发人员：苏循成，张凌阳，赵丽娜，潘彬彬，陈本广，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：