一种O-糖肽键多肽的合成工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种O

【技术实现步骤摘要】
一种O
‑
糖肽键多肽的合成工艺


[0001]本专利技术涉及糖肽合作
，具体为一种O
‑
糖肽键多肽的合成工艺。

技术介绍

[0002]多肽的人工糖基化修饰主要利用糖的半缩醛羟基与多肽N端的α
‑
氨基，天冬酰胺的酰胺基形成N
‑
糖基化修饰，或者利用糖的半缩醛羟基与多肽中丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸的羟基为连接点，形成
‑
O
‑
糖苷键型。此种方式难以实现定点修饰，造成位点紊乱或错误，为目标肽的获得增加了难度。因此需要一种能够对多肽指定位置，指定氨基酸的糖基化修饰，降低合成难度，避免多杂质的产生，提高产品的收率的合成工艺。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种O
‑
糖肽键多肽的合成工艺，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种O
‑
糖肽键多肽的合成工艺：
[0005]①
、Ser(O
‑
GlcNAc)和Thr(O
‑
GlcNAc)的制备
[0006]S1、Ser(O
‑
GlcNAc)的制备
[0007]取0.5份的过乙酰化的乙酰氨基半乳糖与0.3份的Fmoc
‑
ser
‑
oh溶解于50份无水二氯甲烷与10份的无水乙腈混合溶液中，加入1
‑
2eq的三氟化硼乙醚进行催化，放置于微波反应仪中反应5min，反应温度为100摄氏度；反应结束后使用旋转蒸发仪将产物旋干，再使用Hplc将产物进一步提纯得到98％的Ser(O
‑
GlcNAc)；
[0008]S2、Thr(O
‑
GlcNAc)的制备
[0009]取0.5份的过乙酰化的乙酰氨基半乳糖与0.3份的Fmoc
‑
thr
‑
oh溶解于50份无水二氯甲烷与10ml的无水乙腈混合溶液中，加入1
‑
2eq的三氟化硼乙醚进行催化，放置于微波反应仪中反应5min，反应温度为100摄氏度，反应结束后使用旋转蒸发仪将产物旋干，再使用Hplc将产物进一步提纯得到98％的Thr(O
‑
GlcNAc)；
[0010]②
、CG
‑
[Ser(O
‑
GlcNAc)]‑
GG
‑
[Thr(O
‑
GlcNAc)]‑
GG
‑
[Ser(O
‑
GlcNAc)]‑
GL的合成；
[0011]S1、树脂溶涨
[0012]将2
‑
Chlorotrityl Chloride Resin树脂放入反应管中，加DCM(15ml/g)，振荡30min；
[0013]S2、接第一个氨基酸
[0014]取S1步骤生成物通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc
‑
Leu
‑
OH，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入DMF溶解，振荡60min，并使用甲醇封头，静置30min；
[0015]S3、脱保护
[0016]取S2步骤生成物去掉溶剂，加20％哌啶/DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶/DMF溶液(15ml/g)，15min；
[0017]S4、检测
[0018]取S3步骤生成物抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入Kaiser试剂，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应；
[0019]S5、洗
[0020]取S4步骤生成物依次经过：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次；
[0021]S6、链接
[0022]取S5步骤生成物、3倍摩尔过量的氨基酸Fmoc
‑
gly
‑
OH、3倍摩尔过量的HBTU，均用DMF溶解，加入反应管，立刻加入10倍摩尔过量DIEA，反应30min。
[0023]S7、检测
[0024]取S6步骤生成物，抽掉溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入Kaiser试剂，105℃－110℃加热5min,无色为阴性反应，说明反应完全。
[0025]S8、洗
[0026]取S7步骤生成物依次经过DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次；
[0027]S9、重复S3
‑
S8步操作，依次连接多肽中的氨基酸包括糖修饰单元，抽干树脂；
[0028]S10、从树脂上切割片段肽
[0029]配制切割液(10/g)TFA 95％，EDT 2％，TIS 2％，H2O 1％
[0030]切割时间：120min；
[0031]S11、将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥发干；
[0032]S12、将多肽中间体溶于饱和甲醇钠/甲醇溶液至于烧瓶，氮气保护，室温，磁力搅拌至反应结束；
[0033]S13、抽滤去除未反应的甲醇钠，滤液旋蒸去除甲醇得粗产品；
[0034]S14、取粗品小样进HPLC分析，设置时间为0
‑
20min，设置梯度为5
‑
95，进行检测；根据出峰时间，设置梯度为35
‑
100平衡制备HPLC，色谱柱固定相为烷基键合硅胶，流动相为乙腈
‑
TFA溶液，收集目标峰的洗脱液；
[0035]S15、冻干得到白色粉末状终产品，纯度为98％。
[0036]更进一步的，步骤
①
中，乙酰氨基半乳糖过乙酰化：将1gGlcNAc溶于10ml的吡啶溶液中，然后缓慢加入10ml乙酸酐溶液，室温反应24小时，反应完成后调节PH至中性，加入50ml无水二氯甲烷和10ml超纯水，移至分液漏斗中进行分液保留二氯甲烷相，使用旋转蒸发仪去除二氯甲烷，在剩余溶液中加入乙醚析出产物并冻干。
[0037]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：一种O
‑
糖肽键多肽的合成工艺突破固有修饰方法，开发一种新型的单元构建法实现糖修饰肽的合成，探索合适糖修饰合成工艺以降低产品的合成难度，避免了多种杂质的生成，实现糖修饰的定点或多位点生成，增加产品的收率，使得糖修饰肽位点筛选成为现实。
[0038]本技术具体通过单元构建法实现糖修饰肽的合成，即先将乙酰化保护的糖，与丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸的羟基事先反应好形成一个构建单元，氨基酸的α
‑
氨基用Fmoc保护，在多肽合成的过程中，在需要的位置将这些氨基酸引入，然后通过去乙酰酯，脱除糖保护乙酰基，即可实现多肽指定位置，指定氨基酸的糖基化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种O
‑
糖肽键多肽的合成工艺，其特征在于：
①
、Ser(O
‑
GlcNAc)和Thr(O
‑
GlcNAc)的制备S1、Ser(O
‑
GlcNAc)的制备取0.5份的过乙酰化的乙酰氨基半乳糖与0.3份的Fmoc
‑
ser
‑
oh溶解于50份无水二氯甲烷与10份的无水乙腈混合溶液中，加入1
‑
2eq的三氟化硼乙醚进行催化，放置于微波反应仪中反应5min，反应温度为100摄氏度；反应结束后使用旋转蒸发仪将产物旋干，再使用Hplc将产物进一步提纯得到98％的Ser(O
‑
GlcNAc)；S2、Thr(O
‑
GlcNAc)的制备取0.5份的过乙酰化的乙酰氨基半乳糖与0.3份的Fmoc
‑
thr
‑
oh溶解于50份无水二氯甲烷与10ml的无水乙腈混合溶液中，加入1
‑
2eq的三氟化硼乙醚进行催化，放置于微波反应仪中反应5min，反应温度为100摄氏度，反应结束后使用旋转蒸发仪将产物旋干，再使用Hplc将产物进一步提纯得到98％的Thr(O
‑
GlcNAc)；
②
、CG
‑
[Ser(O
‑
GlcNAc)]
‑
GG
‑
[Thr(O
‑
GlcNAc)]
‑
GG
‑
[Ser(O
‑
GlcNAc)]
‑
GL的合成；S1、树脂溶涨将2
‑
ChlorotritylChloride Resin树脂放入反应管中，加DCM(15ml/g)，振荡30min；S2、接第一个氨基酸取S1步骤生成物通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc
‑
Leu
‑
OH，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入DMF溶解，振荡60min，并使用甲醇封头，静置30min；S3、脱保护取S2步骤生成物去掉溶剂，加20％哌...

【专利技术属性】
技术研发人员：查卫松，
申请(专利权)人：湖北强耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：