一种从头合成壳寡糖的多酶催化体系及其全细胞生产方法技术

本发明专利技术公开了一种从头合成壳寡糖的多酶催化体系及其全细胞生产方法，属于合成生物学领域和生物医药制备技术领域。本发明专利技术通过AmgK、GlmU、NodC、NodB的组合，构建了以乙酰氨基葡萄糖为底物单元从头合成壳寡糖的一种多酶催化体外途径；利用该酶组合与辅因子再生系统的偶联，底物磷酸化速率和聚合速率得到调控，壳寡糖聚合度可控(DP<10)、分子量均一(～1000Da)。在此基础上以大肠杆菌为底盘菌，将所述酶组合中的基因整合到表达载体或基因组中进行过表达，同时过表达K

【技术实现步骤摘要】
一种从头合成壳寡糖的多酶催化体系及其全细胞生产方法


[0001]本专利技术涉及一种从头合成壳寡糖的多酶催化体系及其全细胞生产方法，属于合成生物学领域和生物医药制备


技术介绍

[0002]壳寡糖(chitooligosaccharide或者chitosan oligomers)是由<20个氨基葡萄糖或N
‑
乙酰氨基葡萄糖通过β
‑
1,4糖苷键连接而成的寡聚物，属于几丁质衍生物。几丁质和壳聚糖都具有重要的生物活性，这使得它们在食品、化妆品、医药和农业工业中很受欢迎。然而，这些生物高聚物的高分子量限制了它们的潜在用途，这使得它们在中性pH下的溶解度很差。有趣的是，这种限制可以通过使用壳低聚糖来克服，β
‑1‑4‑
连接的GlcNAc或GlcN的同源或异源低聚物，聚合度(DP)从2到10较低。与甲壳素和壳聚糖相比，壳寡糖具有分子量小、溶解度高、吸附能力强、生物相容性好等优点。此外，壳寡糖具有广泛的生物功能，如抗氧化剂、抗炎药、抗菌药、抗肿瘤药、抗高血压药以及益生元特性，因此在营养品、化妆品和制药领域显示出巨大潜力。
[0003]小分子量(～1000Da)壳寡糖已被证实具有抗炎、抗肿瘤及激活植物免疫等多种生物活性。壳寡糖的结构，如聚合度、脱乙酰度及乙酰基位点在寡糖链上的分布都可能影响其与特定受体的结合能力，从而影响其生物活性。传统壳寡糖规模制备中，首先采用溶解性差的高脱乙酰度壳聚糖作为底物，制备方法主要分为物理、化学、酶解法3大类。酶解法具有无污染、产物得率高、产品生物活性高等优点，克服了物理法效率低以及化学法污染环境的缺点。但是，以虾壳来源的壳聚糖为前体生产壳寡糖，仍然存在前体预处理复杂、环境不友好、以及壳聚糖水解酶活性低等缺陷，限制了规模化工业应用。

技术实现思路

[0004]目前的研究发现微生物中存在以乙酰氨基葡萄糖为受体和UDP
‑
乙酰氨基葡萄糖为供体，合成几丁质寡糖的关键酶(几丁质合成酶NodC)。因此，设计特定的从头合成途径，通过多种酶混合的催化反应，直接以葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖为单糖底物，聚合形成壳寡糖将有望成为可能。同时，该类型的多酶催化体系可在全细胞内进行整合，是一种低成本、低污染、低能耗的壳寡糖制备技术。
[0005]本专利技术采用微生物资源及其数据库，挖掘了新型酶分子，开发出了均一分子量壳寡糖的多酶催化的从头合成途径(以乙酰氨基葡萄糖为底物)，实现了该新途径实现在工程菌株中的合理组装，从而为获得了以葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖为底物从头合成壳寡糖的全细胞催化体系及其生产方法。本专利技术的目的在于提供一种壳寡糖从头合成的催化途径、多酶催化体系、全细胞转化的工程菌及生产方法。
[0006]本专利技术的首先提供一种具有以乙酰氨基葡萄糖为出发单糖、从头合成均一分子量壳寡糖的多酶催化体系，所述酶催化体系主要包括N
‑
乙酰氨基葡萄糖激酶(AmgK)、UDP
‑
N
‑
乙酰葡糖胺焦磷酸化酶(GlmU)、几丁质合成酶(NodC)、脱乙酰基酶(NodB)。
[0007]在一种实施方式中，所述N
‑
乙酰氨基葡萄糖激酶AmgK来源于Pseudomonas aeruginosaATCC 15692；所述UDP
‑
N
‑
乙酰葡糖胺焦磷酸化酶GlmU来源于Escherichia coli MG1655；所述几丁质合成酶NodC和脱乙酰基酶NodB来源于Azorhizobium caulinodans ORS 571。
[0008]在一种实施方式中，编码所述AmgK的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]在一种实施方式中，编码所述GlmU的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]在一种实施方式中，编码所述NodC的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]在一种实施方式中，编码所述NodB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0012]在一种实施方式中，所述的多酶催化体系还含有以下任一组合：
[0013](a)腺嘌呤核苷三磷酸和尿苷三磷酸；
[0014](b)来源于Ruegeria pomeroyi的多聚磷酸盐激酶、二磷酸腺苷及尿苷二磷酸。
[0015]本专利技术的第二个目的是提供利用所述多酶催化体系生产壳寡糖的方法，所述方法是以乙酰氨基葡萄糖为底物，转化合成壳寡糖。
[0016]在一种实施方式中，将所述N
‑
乙酰氨基葡萄糖激酶、UDP
‑
N
‑
乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、几丁质合成酶和脱乙酰基酶按照相同的酶活量加入反应体系中，每种酶按照每毫摩尔底物添加 100～200U；并添加1/2底物浓度的ATP和UTP，在pH6.5～7.5下反应不少于6h。
[0017]在一种实施方式中，乙酰氨基葡萄糖浓度为100～500mM，N
‑
乙酰氨基葡萄糖激酶、UDP
‑ꢀ
N
‑
乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、几丁质合成酶、脱乙酰基酶和多聚磷酸盐激酶的比例为 (1～2):(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)，且各种酶按照不少于每毫摩尔底物100U的量添加至反应体系中；二磷酸腺苷初始浓度为50～100mM，在30～40℃下反应，多聚磷流加速度为1～100mg/L/min， pH6～8。
[0018]优选的，N
‑
乙酰氨基葡萄糖激酶、UDP
‑
N
‑
乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、几丁质合成酶、脱乙酰基酶和多聚磷酸盐激酶的比例为1:1:1:1:1、1:1:2:2:1或2:2:1:1:1；所述反应温度为40～50℃，辅因子浓度为50～100mM。
[0019]本专利技术的第三个目的是提供一种基因工程菌，是在大肠杆菌中削弱pgm和nagB的表达并敲除murQ，并将编码葡萄糖合成酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、葡萄糖
‑1‑
磷酸N乙酰基转移酶的基因的启动子替换为组成型启动子J23119得到大肠杆菌底盘细胞，在大肠杆菌底盘细胞中表达来源于Pseudomonas aeruginosa ATCC 15692的N
‑
乙酰氨基葡萄糖激酶、来源于 Escherichia coli MG1655的UDP
‑
N
‑
乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、来源于Azorhizobium caulinodansORS 571的几丁质合成酶和脱乙酰基酶、以及来源于Ruegeria pomeroyi的多聚磷酸盐激酶。
[0020]在一种实施方式中，以敲除了lacI序列的pTrc99A质粒为所述几丁质合成酶和脱乙酰基酶的表达载体；在质粒pACYC184上整合trc启动子和rrnB T1终止子，用以表达所述N
‑
乙酰氨基葡萄糖激本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可从头合成壳寡糖的多酶催化体系，其特征在于，所述催化体系包含来源于Pseudomonas aeruginosa ATCC 15692的N
‑
乙酰氨基葡萄糖激酶、来源于Escherichia coli MG1655的UDP
‑
N
‑
乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、来源于Azorhizobium caulinodans ORS 571的几丁质合成酶和脱乙酰基酶催化底物合成壳寡糖。2.根据权利要求1所述的多酶催化体系，其特征在于，所述体系还含有以下任一组合：(a)腺嘌呤核苷三磷酸和尿苷三磷酸；(b)来源于Ruegeria pomeroyi的多聚磷酸盐激酶、二磷酸腺苷及尿苷二磷酸。3.利用权利要求1或2所述的多酶催化体系生产壳寡糖的方法，其特征在于，以乙酰氨基葡萄糖为底物，转化合成壳寡糖。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将所述N
‑
乙酰氨基葡萄糖激酶、UDP
‑
N
‑
乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、几丁质合成酶和脱乙酰基酶按照相同的酶活量加入反应体系中，每种酶按照每毫摩尔底物添加100～200U；并添加1/2底物浓度的ATP和UTP，在pH6.5～7.5下反应不少于6h；或者，乙酰氨基葡萄糖浓度为100～500mM，N
‑
乙酰氨基葡萄糖激酶、UDP
‑
N
‑
乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、几丁质合成酶、脱乙酰基酶和多聚磷酸盐激酶的比例为(1～2):(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)，且各种酶按照不少于每毫摩尔底物100U的量添加至反应体系中；二磷酸腺苷初始浓度为50～100mM，在30～40℃下反应，多聚磷流加速度为1～100mg/L/min，pH6～8。5.一种基因工程菌，其特征在于，在大肠杆菌中削弱pgm和nagB的表达并敲除murQ，并将编码葡萄糖合成酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、葡萄糖
‑1‑
磷酸N乙酰基转移酶的基因的启动子替换为组成型启动子J23119得到大肠杆菌底盘细胞，在大肠杆菌底盘细胞中表达来源于Pseudomonas aeruginosa ATCC 15692的N
‑
乙酰氨基葡萄糖激酶、来源于Escheri...

【专利技术属性】
技术研发人员：方真，丁春华，沙冲，章文劼，
申请(专利权)人：江苏海飞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：